DAPI染色を用いた細胞死スクリーニング:がん細胞株におけるIR誘導クローン性細胞死の迅速スクリーニング法

要約

出典: Kobayashi, D. et al. 蛍光顕微鏡による放射線誘発クローン細胞死の様式の評価のためのワンステッププロトコル。 (2017年)

このビデオは、DAPI染色アッセイを使用して電離放射線(IR)誘発がん細胞株の主要な細胞死プロファイルをスクリーニングする方法を示しています。細胞死を受けている標的細胞のDAPI染色された核は、明確な形態を示し、蛍光顕微鏡で容易に同定できます。

プロトコル

1. 材料の準備

1. オートクレーブカバースリップ
   1. カバースリップをガラスビーカーに入れます。
   2. ガラスビーカーをホイルで覆います。
   3. 121°C、15psiで20分間オートクレーブします。
   4. 50°Cで乾燥させ、培養フードに室温で保存します。
2. 固定液を調製します:3%パラホルムアルデヒド+ 2%スクロースをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶かします。
   1. 1,000 mLのガラス瓶に、700 mLのPBSと30 gのパラホルムアルデヒドを加えます
      注意：パラホルムアルデヒドは腐食性がありますので、適切な手袋を着用してください。
   2. パラホルムアルデヒドを電子レンジで80°Cに加熱し、完全に溶解します
      注意：パラホルムアルデヒドの煙は有毒ですので、マスクを着用してください。
   3. 室温で一晩放置します。
   4. スクロース20gを加えます。
   5. PBSを追加して、合計容量を1Lにします。
   6. 50mLチューブで分注します。.固定液は、-20°Cで3年間、または4°Cで3ヶ月間保存できます。

2. 照射

>注意:X線照射器は、メーカーの指示に従って慎重に取り扱ってください。

1. 逆相顕微鏡で細胞を検査します。セルがカバースリップに付着し、生きていることを確認します。
2. 6 GyのX線(1.4 Gy/min、300 KVP、20 mA)を皿に照射します。
3. 5% CO₂.
   を含む雰囲気中で 37 °C で 72 時間インキュベートします。 手記：インキュベーション時間は、実験デザインに応じて変更することができます

3. 固定

1. 皿から培地を吸引します。
2. 1,000μLのマイクロピペットチップの先端をハサミで5mm先から切り取ります
   手記：先端をカットすることで、固定液をスムーズに塗布することができます。
3. カットチップを使用して、1 mLの固定液(ステップ1.2で調製)をディッシュの側壁からディッシュに加えます><。 手記：このステップは時間に敏感であるため、複数のサンプルを取り扱う場合はマイクロピペットの先端を変更せずに実行する必要があります。固定液を皿の底に直接塗布すると、細胞が損傷する可能性があります。
4. 皿を正方形の培養皿に入れます。正方形の培養皿を静かに振って、固定溶液をカバーガラス全体に均等に分散させます。
5. 室温で10分間インキュベートします。
6. 皿から固定液を吸引します。
7. 皿の側壁から皿に2mLのPBSを追加します.
   手記：PBSを皿の底に直接塗布すると、細胞が損傷する可能性があります。
8. 皿からPBSを吸引します。
9. 手順 3.7 と 3.8 を 2 回繰り返します。
   手記：ディッシュは、カバーガラスを2mLのPBSに浸した状態で4°Cで1週間保存できます。

4. DAPI染色

1. スライドガラスに5 μL 1 μg/mL DAPI染色試薬を塗布します
   手記：DAPI染色試薬は、-20°C以下で光を避けて保存した場合、6ヶ月間安定です。
2. メスを使用して、カバースリップを皿から取り外します。
3. ペーパータオルでカバーガラスの端に触れて、カバーガラスの余分なPBSを引き出します。
4. スライドガラス上のDAPI染色試薬の滴にカバースリップを逆さまに取り付けて、細胞がDAPI染色試薬にさらされるようにします><。 手記：この手順は時間的制約があります。DAPI染色試薬を乾燥させると、染色が最適ではない可能性があります。
5. サンプルは-20°Cで1年間保存できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カバースリップ	松波	C013001
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	P6148-1KG
蔗糖	シグマ・アルドリッチ	84097から250G
リン酸緩衝生理食塩水	コスモバイオ	16232000
メス	貝印メディカル	No.20、520-A
35 mm細胞培養ディッシュ	隼	353001
逆位相顕微鏡	島津	114から909
X線照射器	Faxitron バイオオプティクス	ファックストロン RX-650
スクエアカルチャーディッシュ	コーニング	431110
スライドガラス	松波	プロ-11
DAPI染色試薬	細胞シグナル伝達	8961Sの
蛍光顕微鏡	ニコン	エクリプスNi
蛍光顕微鏡 DAPIフィルター	ニコン	U-FUW、BP340-390、BA420IF、DM410
蛍光顕微鏡レンズ (20×)	ニコン	プランアポλ 20X/0.75
蛍光顕微鏡レンズ(60×、油彩)	ニコン	プランアポλ60X / 1.40オイル
油	オリンポス	N5218600
CCDカメラ	ニコン	DS-Qi2
デジタル画像取り込みソフトウェア	ニコン	NIS-Elements ドキュメント
レンズクリーナー	オリンポス	OT0552
クロロホルム	和光	035-02616

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