脱細胞化ブタ食道足場調製:ブタ食道から無細胞足場を生成する技術

要約

出典:Green, N. H. et al.3D組織工学によるヒト食道粘膜モデルの作成、特性評価、および潜在的な使用。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオでは、組織工学アプリケーションのための、その生化学的構造と組成が保存された脱細胞化ブタ食道足場の準備を示しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 脱細胞化食道足場の準備

1. 食肉処理場で、食用に使用される屠殺されたばかりのランドレース豚から無傷の豚食道を入手します。1つの食道は、約30の別々の構築物に十分な足場を提供します.
   手記：広範で時間のかかる滅菌プロトコルが必要なため、通常は一度に最低10個の食道を取得して処理する価値があります。
2. 切除したばかりの食道を、約150mLの10%ポビドンヨード溶液が入った180mLの滅菌ポットに5分間入れて、汚染微生物の負荷を減らします。食道を、200 IU/mL ペニシリン、200 μg/mL ストレプトマイシン、および 1.25 μg/mL アムホテリシン B を含む約 100 mL の滅菌 PBS が入った 2 番目のポットに移します。
   1. 容器の蓋を元に戻し、食道を室温で実験室に戻します。食道は、サイズに応じて、各コンテナで2つまたは3つ輸送できます。
3. ラボに到着したら、微生物汚染を最小限に抑えるために、無菌技術を使用して層流フードで組織を取り扱います。ピンセット、はさみ、メスの刃を70%エタノールに5分間浸し、滅菌PBSですすいで
滅菌します。
4. 滅菌ピンセットを使用して食道を取り扱います。ハサミを使って、食道を縦に切り開きます。食道を約100 mLの滅菌PBSが入った180 mLの滅菌ポットに入れ、穏やかに振って破片を取り除き、組織をすすぎます。.
5. コルク解剖ボードに70%エタノールをたっぷりとスプレーして洗浄し、乾燥させます。
6. PBSから食道を取り外し、滅菌針を使用して、食道をボードにピンで留め、粘膜表面を一番上にします。食道の一方の端にある粘膜表面を滅菌ピンセットでつかみ、ボードから引き離します。これにより、粘膜が下にある粘膜下組織から分離されます。
   1. 次に、滅菌メスの刃を使用して、食道を固有椎弓板に沿って縦方向に解剖し、解剖が進行するにつれてピンを取り除き、粘膜を持ち上げることができます。
7. 解剖した粘膜を保持し、下にある粘膜下組織を廃棄します。
8. 粘膜の最も近位と遠位の2 cmを切り取って廃棄します。これらの領域には、それぞれ粘膜下腺の数が多く、固有層が厚いためです。
9. メスを使用して、残りの組織を^5cm2に切ります。切断したすべての組織を、約150 mLの滅菌PBSが入った180 mLの滅菌ポットに入れ、穏やかに攪拌して組織をすすぎます。.一度に5つ以上の食道を処理する場合、このステップと後続の3つのステップで複数のポットを使用する必要がある場合があります。
10. 滅菌ピンセットを使用して、切断した組織を150 mLの滅菌1 M NaCl、200 IU/mLペニシリン、200 μg/mLストレプトマイシン、および1.25 μg/mLアムホテリシンBを入れた180 mLポットに移します。
11. 150 mLの滅菌PBSが入った新鮮な180 mLポットに組織を入れます。上皮は、下にある組織から目に見えて分離し始めます。滅菌鉗子を使用してブタの食道から剥離した上皮をそっと剥がし、廃棄します。
    1. 残りの組織を新鮮な180mLのポットに入れ、150mLの滅菌PBSを追加します。5分間静かに攪拌して洗います。PBSを注ぎ、新しいPBSでさらに2回繰り返します。
12. すべての組織を、400 mLの滅菌80%(v / v)グリセロール溶液が入った500 mLのガラス瓶に室温で24時間入れます。400 mLの滅菌90%(v / v)グリセロール溶液にさらに24時間移します。
13. 400 mLの滅菌100%グリセロール溶液に室温で最低4か月間保存し、基底膜の完全性を維持しながら組織を脱水および滅菌します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	ラボテック	LM-D1112	使用前に37°Cのウォーターバスで温めてください
ハムのF12	ラボテック	LM-H1236	使用前に37°Cのウォーターバスで温めてください
胎児の子牛血清	ラボテック	FB-1090
上皮成長因子	R+Dシステム	236-EG-200	200 μg/ml ストック溶液を 10 mM 酢酸、1% FCS で調製します
コレラ毒素	シグマ・アルドリッチ	C8052	水溶液を調製します
L-グルタミン	シグマ・アルドリッチ	G7513
ペニシリン-ストレプトマイシン	シグマ・アルドリッチ	P0781
アムホテリシンB	ギブコ	15290-026	ブランド名:ファンジゾン
PBSの	オキソイド	BR0014	1錠を100mlの水に溶かし、オートクレーブして滅菌します
コラゲナーゼA	ロシュ	10103578001
ポビドンヨード溶液	エコラボ	10830E	ブランド名:Videne
エタノール	シグマ・アルドリッチ	E7023
キレックス100	シグマ・アルドリッチ	C7901
新生仔牛血清	ギブコ	26010074
15mlユニバーサルチューブ	SLSの	SLS7504
180mlポット	VWRの	〒216-2603

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