磁気ビーズを用いたエキソソーム抽出:生体液から特定のエクソソームを単離する技術

要約

出典:Tu, M. et al.電界誘起放出および測定(EFIRM)によるエキソソームバイオマーカーの検出。J. Vis. Exp.(2015年)

この動画では、磁性マイクロビーズを用いて標的生体液からエクソソームを単離する手順を実演します。この手順により、エクソソームの迅速な捕捉が可能になり、下流の分析に使用できます。

プロトコル

1. マグネティックビーズを用いたエクソソーム抽出

1. ストレプトアビジンでコーティングされた磁性微粒子5 μLの溶液を、495 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)バッファーによく混合した溶液を微量遠心チューブ内でピペットで移し、ビーズを再懸濁します。ビーズを500 μLのPBSで磁気ラックを使用して3回洗浄し、再懸濁します。ラックは、サンプル微量遠心チューブを保持できるハウジングユニットの側面にある磁石の配列です。
   1. 洗浄のたびに、まずチューブをラックに1分間置いてから、ピペットチップを使用して、ビーズを乱さずに上清バッファーを慎重に取り除きます。
   2. チューブを側面に磁石のない通常のラックに置きます。500 μLのPBSをチューブに加え、ピペットを使用して溶液とビーズを混合します。次に、チューブを磁気ラックに戻し、ビーズを溶液から再度分離します。
   3. このバッファーの除去を、PBSでの磁化と再懸濁によって合計3回行います。これにより、磁性粒子の初期洗浄が行われます。
2. ビーズを490 μLのPBSバッファーに再懸濁し、チューブを磁気ラックの非磁化部分に置きます。ビオチン化マウス抗ヒトCD63抗体5 μLを1.0 mg/mLのストック濃度でビーズの混合物にピペットで入れます。ピペットを使用して、ビーズと抗体を溶液中で混合します。
3. ビーズとビオチン化抗体混合物を含ませた微量遠心チューブをサンプルローテーター上に置きます。サンプルローテーターのローテーターパラメータを、90°の傾斜で5秒間、5°で1秒間の振動で往復回転するように設定します。これらのパラメータでサンプル-ビーズ混合物チューブをRTで30分間回転させます。
4. 標識後に未結合の抗体を除去します。
   1. RTで30分間回転した後、チューブを磁気ラックに5分間戻します。
   2. マイクロピペットで液相を除去してビーズを3回洗浄し、500μLのPBSで洗浄します。トリプル洗浄後、ビーズを490 μLのカゼイン-PBSに再懸濁し、ラックの非磁性部分に置きます。
5. 抗体被覆ビーズを用いたエキソソーム抽出。
   1. 各チューブに目標とするサンプルIDをラベル付けし、10 μLの血清または唾液のサンプルをマイクロ遠心チューブにピペットで移します。ピペットを使用して、サンプルと磁気ビーズを数回ピペッティングして混合します。
   2. サンプルと抗ヒトCD63抗体ビーズの入ったチューブをローテーターに置き、RTで2時間回転させます。ステップ1.3で説明したのと同じローテーターパラメーターを使用します。
   3. サンプルを2時間回転させた後、磁化して溶液からビーズを分離し、マイクロピペットで液相を除去し、ビーズを500 μLのTris-HClバッファーに再懸濁して、トリプルウォッシュを行います。得られたビーズはエクソソームに結合し、電界放出と測定の準備が整います。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ビオチン化抗ヒト CD63 抗体	Ancell, アメリカ	〒215-030
ダイナビーズマイワンストレプトアビジンT1	Invitrogen, アメリカ	65601
Neodynium Magnetics(直径1/10インチ×厚さ1/32インチ)	K&Jマグネティックス、米国	DH101
超高純度蒸留水	Life Technologies(米国)	〒10977-023
抗フルオレセインPOD、Fabフラグメント	ロシュ(ドイツ)	11426346910
リン酸緩衝生理食塩水	Life Technologies(米国)	10010023
カゼイン/PBS	フィッシャーサイエンティフィック、米国	37532