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人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。
1. 組織消化
- 100 mmの組織培養プレートを使用して、オートクレーブ滅菌された解剖ハサミと外科用鉗子を使用して、組織を機械的に1~2 mmのサイズの細かい断片にミンチにします(図1B、C)。ピース間の結合組織を切断して、適切な分離を確保し、次のステップを容易にする必要があります。
- 6 mLのディスパーゼ/コラゲナーゼ溶液をミンチ組織に加えます。.その後、37°Cで約30分から1時間インキュベートします。
- 5 mLの血清ピペットで15〜20回ピペッティングして、組織を破壊します。
- 37°Cでさらに30分から1時間インキュベー
トします。
- 手順1.3と1.4をさらに2〜3回、または組織がスラリーに似てピペットの開口部を簡単に通過できるようになるまで繰り返します(図1D).
手記： 組織標本の開始サイズと組織ミンチの細かさによって、ステップ1.3と1.4を繰り返す必要がある回数が決まります。通常、約1cm×1cmの大きさのティッシュを受け取ります。さらに、標準的な倒立組織培養顕微鏡を使用して組織の解離をモニターし、組織からの細胞解離の進行を追跡することができます。細胞の小さなクラスターは、唾液球としての唾液細胞の初期成長に理想的です。
2. 基底膜マトリックスによる井戸のコーティング
>注:基底膜マトリックス(BMM)は、使用する前日に4°Cで一晩解凍する必要があります。解凍後、BMMは暖かい温度で急速に固化(つまり、ゲルを形成する)するため、氷上または4°Cで常に維持する必要があります。さらに、BMMにめっきする前にサンプルを氷上で冷却した場合は、冷たいサンプルがBMMを「溶かし」、細胞をプラスチック皿にさらすため、注意が必要です。
- BMM(材料の表を参照)をゆっくりとピペットで各ウェルに注入します。BMMを井戸全体に均等にゆっくりと分配します.
注:通常、6ウェルプレートの各ウェルあたり500μLを使用しますが、この容量は、12ウェルや24ウェルなどの他のプレートのバリエーションで使用するために、または必要に応じて、より厚いまたはより薄いハイドロゲルに調整することができます。
- コーティングされたプレートを使用前に少なくとも15分間インキュベートして、BMMが固化する時間を確保します。
3. 未消化組織のろ過、RBC溶解、細胞プレーティング
- ステップ1.5から組織ホモジネートを15 mLコニカルチューブに移します。6 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)でプレートを1回洗浄し、残りの細胞を移します。
- ホモジネートを70 μmのナイロンメッシュセルストレーナーを介して50 mLのコニカルチューブにろ過し、未消化組織を除去します。濾過した細胞を500 x gで5分間遠心分離します。
- 10x RBC溶解バッファーを滅菌dH2Oで希釈し、1xワーキング溶液を調製します。
- 上清を吸引します。次に、細胞ペレットを10 mLの1x RBC溶解バッファーに再懸濁します。37°Cで5分間インキュベートします。
- 20〜25 mLのDPBSを添加して、RBC溶解バッファーを中和し、唾液細胞の溶解を最小限に抑えます。500 x g.
で5分間遠心分離します。
手記：RBC溶解バッファーで処理した後、細胞ペレットは白色であるべきです。ペレットの赤色は、すべてのRBCが完全に溶解されていないことを示しています。必要に応じて、手順3.4から3.5を繰り返して、すべてのRBCを完全に溶解します。
- 上清を吸引します。ペレットをウェルあたり1〜2 mLのBEGMに再懸濁し、再懸濁した細胞をBMMコーティングウェル上に置きます。37°Cでインキュベートします。
- BMMに播種すると、細胞は2〜3日かけて球状構造または「唾液球」に形成されます。BMMが分解し始める前に、細胞は約5〜7日間唾液球として維持することができ、細胞がプラスチックにアクセスして接着し、単層として成長することができます。