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1. ナノ粒子プローブの調製
>注:このアッセイは、ニュートラアビジンポリマー(AV)と共有結合し、DFM照明時に赤色(641 nmピーク)散乱信号を生成する表面プラズモン共鳴ピークを有する官能基化された金ナノロッド(AuNR;直径25 nm x 長さ71 nm)を利用しています。
- 40 μL の AuNR-AV (2.56 x 1011 粒子) を 200 μL PBS (pH 7.0) で 3 回洗浄し、遠心分離および吸引 (8,500 x g を 4 °C で 10 分間) し、その後、最終遠心分離および吸引ステップを行った後、AuNR-AV ペレットを 40 μL PBS に懸濁します。
- このAuNR-AV懸濁液を、目的のエキソソームサブタイプの表面上の抗原に特異的な10 μLのビオチン化抗体(0.5 mg/mL)および150 μLのPBSと混合し、ミキサーを使用して4°Cで2時間混合し、ニュートラアビジン-ビオチン結合が完了するまで待ちます。
- 得られた抗体標識AuNR(AuNR-IgG)を遠心分離および吸引(6,500 x g、4°Cで10分間)で3回洗浄し、200μLのPBSに懸濁し、使用するまで4°Cで保存します
手記：AuNR-IgGの汚染と劣化を避けるために、滅菌技術と短い保存時間を使用する必要があります。抗体標識AuNRは、標識後24時間以内に使用するのが最善です。
2. EVキャプチャースライドの準備
- 選択したエキソソーム捕捉抗体をPBSで0.025 mg/mLに希釈し、この希釈液の1 μL/ウェルをマルチウェルプロテインA/Gスライドに加え、このスライドを加湿チャンバー内で37°Cで1時間インキュベートして、スライド上に固定化されたプロテインA/Gに捕捉抗体が結合できるようにします。
- ウェルを吸引して未結合の抗体を除去し、PBSの1μL/ウェルを添加して吸引することにより3回洗浄します。次に、各ウェルに1 μLのブロッキングバッファー(材料表を参照)をロードし、加湿チャンバー内でスライドを37°Cで2時間インキュベートして、残りのタンパク質結合部位をブロックします。
- ウェルを吸引してブロッキングバッファーを除去し、PBSの1μL/ウェルを添加して吸引してウェルを3回洗浄し、ブロックされたスライドをすぐにエキソソームの捕捉と分析に使用します。
3. 標準曲線の準備
- 特定のエキソソームサブタイプの絶対存在量または相対存在量を正確に定量するためには、ユーザーは、目的のエキソソーム表面バイオマーカーを均一に発現する純粋なエキソソーム集団で標準曲線を生成する必要があります。この研究では、膵臓がんの病期および予後との関係が報告されている転移関連膜タンパク質であるエフリンA2受容体を発現するエクソソームの存在量を分析します
手記：ヒト膵臓癌細胞株PANC-1およびそのエクソソームは、このタンパク質を発現することが知られており、この細胞株から単離されたエキソソームを使用して、複雑なエキソソームサンプル中にこのタンパク質を発現するエクソソームの数を定量化するための標準曲線を生成した。
- 無血清培養培地で細胞を37°Cで48時間培養して培地中にエキソソームが蓄積するようにした後、懸濁培養物の遠心分離または接着細胞培養物からの培地の直接吸引により、細胞培養上清を単離します。
- 回収した培地を2000 x gで30分間遠心分離し、破片を取り除き、上清を回収します。
- 清澄化した培養上清を、適切な容量の0.45 μmの低タンパク質結合フィルターユニット(例:250 mLポリエーテルスルホン真空ろ過ユニット)でろ過します。
- 得られた濾液を、公称分子量100,000の分子量制限フィルターシステムを用いて3200 x gで遠心分離し、最終容量250 μLまで濃縮します。このフィルターから保持容量を採取し、フィルターを200 μL PBSで洗浄し、この洗浄量を回収したエキソソームサンプル容量と組み合わせます。
- このサンプルを21,000 x gで45分間遠心分離し、沈殿物が収集されないように注意しながら、上清を慎重に回収します。
- 回収した上清を100,000 x gで3時間遠心分離し、エキソソームを沈殿させます。上清を吸引し、エキソソームペレットを100 μL PBSに回収します。
- 得られたエキソソーム懸濁液は、24時間以内に使用する場合は4°Cで、長期保存する場合は-80°Cで保存してください
注:エキソソームサンプルを凍結融解サイクルを繰り返さないでください。
- エキソソーム数の直接測定により(例えば、ナノ粒子追跡分析または調整可能な抵抗パルスセンシングによる、またはエキソソーム量の近似手段としてマイクロビシンコニン酸アッセイまたは同等の方法によるエキソソーム溶解物のタンパク質濃度の測定による)、混合後のエキソソーム懸濁液のアリコートを定量する。
- エキソソーム懸濁液の連続希釈のセットを生成して、ナノ粒子シグナルと入力エキソソーム数またはタンパク質含有量との比較を可能にします。
- 各エキソソーム標準試料1 μLをアッセイプレート上の各複製ウェルに移します
注:標準曲線を使用して、ナノ粒子シグナルとエキソソーム濃度との間の相関線の傾きを計算し、(1)アッセイ性能を評価し、(2)実験サンプル中の標的エキソソームの相対濃度を決定することができます。
4. ヒト血漿または血清サンプルの処理
- 標準的な方法で血漿サンプルまたは血清サンプルを採取し、エキソソーム分析に必要になるまで-80°Cで保存します。室温の水浴でサンプルを急速に解凍します。解凍したサンプルを反転して繰り返し混合し、均一な懸濁液を促進します.
注:血清サンプルと血漿サンプルの結果は、凝固反応中にエキソソームが有意に放出されるため、同等ではない場合があります。
- 血漿または血清サンプルを500 x gで15分間遠心分離し、タンパク質凝集体やその他の破片を沈殿させます。血漿または血清サンプルのアリコートを新しいチューブに移し、PBSを添加して1:1の希釈を生成します。希釈したサンプルを、必要に応じて穏やかなボルテックスまたは反転によって混合します。各血漿または血清懸濁液1 μLをアッセイプレート上の各複製ウェルに移します。
5. エクソソームの捕捉と検出
- ブロックされたEVキャプチャスライドのウェルに1 μL/ウェルのエキソソームサンプルをロードし、サンプルあたり8回の繰り返しを使用して、スライドを加湿チャンバー内で4°Cで一晩インキュベートします。すべてのサンプルウェルを吸引し、PBSの1μL/ウェルを添加してウェルを洗浄し、ロードしたエキソソームサンプルから未結合のエキソソームやその他の汚染物質を除去します。
- サンプルウェルに1 μL/ウェルのAuNR-IgG懸濁液(上記セクション1を参照)をロードし、加湿チャンバー内でスライドを37°Cで2時間インキュベートします。ナノ粒子溶液を吸引し、ミキサーを使用して0.01%Tween-20(PBST)を添加したPBSでスライドを10分間洗浄し、次に回転ミキサーを使用してすべてのサンプルウェルを脱イオン水で10分間吸引して洗浄し、その後のLMDFM画像のために風乾します
注:アッセイ間の変動係数(CV)は、同じサンプルの8回の繰り返しから評価されます。CVが>20%を示すサンプルは情報提供を目的としないと見なされ、十分なサンプルがある場合は繰り返し行う必要があります。