マウスからの無傷の腎臓の抽出:マウスモデルから腎カプセルなしで腎臓を得る技術

要約

出典: Grainger, N. et al. ビブラートム切片によるマウス腎盂のライブで無傷のペースメーカー領域の分離とイメージング. J. Vis. Exp. (2021年)

この動画では、マウスの後腹膜腔から腎臓を摘出する手順を説明しています。抽出された腎臓をさらにマイクロダイセンションして、腎カプセルおよび周囲の脂肪層のない無傷の腎臓を得ることができる。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 腎臓解剖

1. 換気されたフードで3〜4%イソフルランを吸入することにより、マウスに麻酔をかけます。つま先や尾の挟み反射の喪失による深部麻酔の誘発を確認し、その後、頸部脱臼によるマウスの安楽死を行います。
2. 胸部に70%エタノールを塗布して毛皮を湿らせます。外部解剖ハサミを使用して、縦方向の切開で腹腔を開き、ハサミの刃を動物から遠ざける角度にして内臓の損傷を防ぎます。
3. 内部組織鉗子と内部解剖ハサミを使用して、腸をつまんで腹壁から持ち上げます。腸を持ち上げながら、近位十二指腸と遠位結腸で腸の下側を体から解放して、腎臓を含む後腹膜腔にアクセスできるようにします。
4. 腎臓が露出したら、個別に抽出します。尿管の遠位端(腎臓から~4mm離れている)を組織鉗子でそっとつまんで持ち上げます。解剖ハサミを使用して、つまんだ尿管の下を腎臓に向かって切り込みます。腎臓が周囲の結合組織から解放されるまで、腎臓の下を切っていきます
   手記：ビブラトーム切片化中の組織の完全性と切断の一貫性を最大化するには、腎臓をできるだけ無傷でなければならない。これを確実にするために、鉗子や解剖はさみで腎臓をつまんだり切ったりしないでください。
5. 尿管を付着させた腎臓を氷冷したKRB溶液に入れます。対側の腎臓で抽出手順を繰り返して、マウスの体から取り出します。腎臓を氷上のKRB溶液に保持します.
   注:PKJ組織の生存率を維持するために、すぐにプロトコルの次のセクションに進んでください。PKJは解剖学的に腎臓実質の深部に位置しているため、KRB溶液との接触が奪われます。

2. ビブラトーム切片化のために腎カプセルなしで腎臓を準備し

ます

1. 腎臓をシリコンエラストマーでコーティングされた解剖皿(60 mm x 15 mm)に移し、腎臓が完全に沈むまで氷冷したKRB溶液で満たします。
2. 解剖顕微鏡下で、近位尿管に微細なピンを挿入し、薄い前腎嚢または周囲の脂肪組織を通して腎臓を皿の底に固定します
   手記：腎臓実質組織に穴を開けないように注意してください。
3. 細いスプリングハサミと内鉗子を使用して、腎臓の基部から脂肪組織を取り除き、遠位RPと近位尿管を露出させます。
4. 近位尿管と遠位RPの一部を、細いスプリングハサミを使用してRPの基部から取り外します
   手記：周囲の腎臓実質を切らないように注意してください。図 1A の黒い破線は、このカットのおおよその位置を示しています。このカットにより、腎臓に平らな基盤が作成され、組織切片がより均一になります。腎臓を解剖する際には、PKJ領域の解剖学的位置に注意する必要があります。図1Bは、無傷の腎臓を矢状面に沿って切断することで、髄質、乳頭(集結管が収束する遠位髄質)、および近位および遠位のRPを露出させることができることを示しています。図1Cのように乳頭が完全に露出した場合、PKJと近位RP(prox RP)を視覚化できます。ただし、これはビブラトーム技術では行わないでください。この説明は、図1D、EのPKJ領域と中RP領域の透過光画像に示されている解剖学的違いで強調されている、一般的に読者をPKJ位置に向けるためのものです。
5. 細い先端の鉗子で外側の腎臓カプセルを突き刺し、先端を腎臓の体から遠ざけます。両手で鉗子を使用して、カプセルの緩い端をつまんではがします。残りの腎カプセル膜を完全に剥がすまで剥がし続けます.
   手記：腎嚢は、腎臓を取り囲む丈夫な繊維状の層です。最適な切断のためには、ビブラトームセクショニングの前に取り外す必要があります。

結果

図1:基本的な腎臓の解剖学的構造とPKJペースメーカー領域の位置。(A)RPと尿管の向きを示す無傷の腎臓の図。腎動脈と腎静脈はそれぞれ赤と青で表示されます。(B)無傷の腎臓を矢状面に沿って切断して、髄質、乳頭(集光管が収束する遠位髄質)、近位および遠位RPを含む腎臓の内部を露出させることができます。(C)髄質と乳頭を切除して、PKJとprox RPを完全に露出させることができます。(DおよびE)は、それぞれPKJペースメーカー領域および遠位RPからの透過光画像を表す。骨盤の遠位端に向かって順次切片化すると、PKJ領域(Di)の筋肉の半円が結合して、乳頭全体をカプセル化する1つの太い筋肉リング(<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
60 mm x 15 mmシャーレ	シグマ・アルドリッチ	P5481	腎臓シャープ解剖皿
吸収紙	フィッシャーサイエンティフィック	06-666A	塗布前に腎臓を乾燥させるには 膠
B6;129S-GT(ROSA)26Sor/J	ジャクソン研究所	13148	GCaMP3マウス
B6;129S-GT(ROSA)26Sor/J	ジャクソン研究所	24105	GCaMP6fマウス
B6です。FVB-TG(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	ジャクソン研究所	19079	smMHC-CREマウス
C57BL/6-TG(PDGFRA-CRE)1Clc/J	ジャクソン研究所	13148	PDGFRa-CREマウス
エタノール	ファムコ・アーパー	SDAの2B-6	解剖用
極細ボンハサミ	ファインサイエンスツール	14083から08	内部解剖ハサミに使用
細いハサミ	ファインサイエンスツール	14060から09	外部解剖ハサミに使用
細い先端の鉗子	ファインサイエンスツール	11254から20	腎臓の細かい解剖に使用されます
イソフルラン	バクスター	NDC 1001936060	麻酔用
シリコンエラストマー	フィッシャーサイエンティフィック	NC9285739	シルガード184
学生用Adson鉗子	ファインサイエンスツール	91106から12	を優しく保持して動かすため 腎臓
学生デュモン鉗子	ファインサイエンスツール	91150から20	内部解剖鉗子に使用
バンナスの春はさみ	ファインサイエンスツール	15000から03	の鋭い解剖とクリーンアップに 孤立した腎臓

型 年