出典:Grainger, N. et al.ビブラートーム切片によるマウス腎盂のライブで無傷のペースメーカー領域の分離とイメージング。J. Vis. Exp.(2021年)
このビデオでは、マウスの腎臓全体をビブラトーム切片にして薄いスライスを得る方法を示します。これらのスライスされた組織切片は、さらなる下流分析まで低温で保存することができます。
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方法論記事
マウス腎臓全体のビブラトーム切片作製:マウス腎臓の薄切片を作製する技術
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2023年4月30日
この記事について
要約
プロトコル
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. ソリューションの準備
- 120.35 mM NaCl、5.9 mM KCl、15.5 mM NaHCO3、1.2 mM Na2、HPO4、1.2 mM MgCl2、11.5 mM Glucose、および2.5 mM CaCl2を含む1 Lのクレブスリンガー重炭酸塩(KRB)溶液を調製します。使用日は、KRB溶液を氷上に保持してください.
手記：KRBは4°Cで最大1週間保存でき、使用前に少なくとも10分間、97%O2と3%CO2の混合物で事前に泡立てる必要があります。
2. 腎臓のビブラトーム切片化
- 鈍い先端の鉗子を使用して、準備した腎臓を氷冷したKRB溶液からそっとつかんで取り出します。すぐに腎臓を吸収紙の上に2~4秒間置き、余分な外部水分を取り除きます。吸収紙の上を腎臓をそっと転がして、実質のすべての側面が乾燥し、腎臓がビブラトームステージに最適に接着するようにします。
注:腎盂は腎臓の内側に位置しているため、外側の実質によって保護されているため、この短い乾燥期間は組織の完全性に害を及ぼすことはありません。 - すぐにシアノアクリレート接着剤の薄層(~1 cm2)をビブラトーム試料プレートの基部に塗布し、鈍い鉗子を使用して、尿管側を下にして腎臓を接着剤で覆われた領域に置きます。鉗子の平らな端で腎臓の上部に静かに下向きの圧力を約10〜20秒間加えて、接着剤を乾燥させます.
手記：この手順中に腎臓を安定させるには、接着剤が乾くまで腎臓を直立させておくために、追加の鉗子を使用します。腎臓が直立した状態で検体プレートに付着し、切片がまっすぐに切断されるようにすることが重要です。腎臓が検体プレートに正常に接着したことを確認するには、腎臓の側面をそっと押します。腎臓がプレートに正常に接着した場合、腎臓の基部はプレートに固定されたままである必要があります。 - 試料プレートをバッファートレイの底部にしっかりと固定します。腎臓の上部が完全に浸るようにKRB溶液のレベルを調整します。切片化ステップ中、ビブラトームブレードがバッファートレイの奥深くに移動するにつれて、ブレードホルダーが溶液に浸らないようにKRB溶液を取り出します.
手記：このステップに進む前に接着剤が完全に乾いていない場合、接着剤はしばしば基部から腎臓実質に移動します。この過剰な接着剤により、セクショニングはより変動性が高くなります。これが発生した場合は、プレートから腎臓を取り出し、新しい腎臓の準備を進めます。 - 自動ビブラトームセクショニングの場合は、ビブラトームブレード切断サイクルの開始位置と終了位置を選択します。これらの位置が腎臓から ~0.5 cm から 1 cm 離れていることを確認して、ブレードが進むたびに腎臓平面全体が切断されることを確認します。
- KRB溶液をウェルに充填してマルチウェルプレート(24ウェルまたは48ウェル)を調製し、プレートを氷上に置きます.
手記：生成された場合、個々のセクションを別々のウェルに配置して、セクションの深さを追跡する必要があります。 - 自動カットプロセスを開始します。ブレードの最初の通過中に、ブレードが腎臓の最上部に接触していることを確認してください。接触しない場合は、ブレードの開始Z位置を調整します。
- 鉗子を使用して、腎臓から解放された切片を収集します。すぐに切片を個々のウェルに移し、切片のZ深さをメモして、腎臓切片内のおおよそのPKJ位置を測定します
手記： カットパラメータによっては、一部のセクションがキドニーブロックから自由にカットできない場合があります。これが発生した場合は、細いスプリングハサミを慎重に使用して、腎臓ブロックから切片を切り取ります。また、個々のウェルで自由に浮遊しながら、光学顕微鏡で切片を積極的に視覚化し、最適な切断設定と組織位置を確保することをお勧めします。PKJを含む切片は、通常、腎臓の上部から1000~1500μmのところに由来します。 - PKJ 領域がより明確になるまで、セクショニング プロトコルを続けます。セクショニングが進行する際のPKJ領域の説明については、代表的な結果のセクションを参照してください。
- この時点で、切片が腎臓ブロックから均一に解放され、無傷であることを確認するために、切片作成パラメータを最適化します。さらに、壊れたPKJ壁は崩壊のために壁内の細胞の適切なイメージングを可能にするため、PKJ領域が連続し、壊れていないことを確認してください。壁が壊れた場合は、切片作成速度を下げて切片の厚さを増やし、光学顕微鏡で切片を観察し続けて切断パラメータを微調整します。
- 実験が始まるまで、切片をKRB溶液で4°Cで保存します。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 24ウェル培養プレート | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 142485 | 腎臓スライスを保存するには |
| 48ウェル培養プレート | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 152640 | 腎臓スライスを保存するには |
| 吸収紙 | フィッシャーサイエンティフィック | 06-666A | 接着剤を塗る前に腎臓を乾かすには |
| シアノアクリレート接着剤 | アマゾン | B001PILFVY | 腎臓を試料プレートに接着するため |
| B6;129S-GT(ROSA)26Sor/J | ジャクソン研究所 | 13148 | GCaMP3マウス |
| B6;129S-GT(ROSA)26Sor/J | ジャクソン研究所 | 24105 | GCaMP6fマウス |
| B6です。FVB-TG(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J | ジャクソン研究所 | 19079 | smMHC-CREマウス |
| C57BL/6-TG(PDGFRA-CRE)1Clc/J | ジャクソン研究所 | 13148 | PDGFRa-CREマウス |
| 細い先端の鉗子 | ファインサイエンスツール | 11254から20 | 腎臓の細かい解剖に使用されます |
| ジレット・シルバーブルー・両刃ブレード | アマゾン | B009XHQGYO | ビブラトームのブレードホルダーへの挿入用 |
| 学生用Adson鉗子 | ファインサイエンスツール | 91106から12 | 腎臓をやさしく抱きしめ、動かすために |
| 学生デュモン鉗子 | ファインサイエンスツール | 91150から20 | 内部解剖鉗子に使用 |
| バイブロチェック | ライカ | 14048142075 | 切断中のブレードの動きを校正するためのオプションコンポーネント |
| VT1200 S 振動ブレード ミクロトーム | ライカ | 14912000001 | 構成 1 はプロトコルで使用されます |
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