膀胱腫瘍オルガノイドモデル:レシピエントマウス膀胱への膀胱オルガノイドの同所性移植法

要約

出典:Kim, Y. et al.マウス膀胱腫瘍オルガノイドの培養、操作、および同所性移植。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、培養膀胱腫瘍オルガノイドのマウス膀胱への同所性移植について説明し、腫瘍の発生に対する臓器環境の役割を研究します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 膀胱腫瘍オルガノイド
 

注:膀胱腫瘍オルガノイドは、直径が100〜150μmに達したときに通過することをお勧めします。

1. 腫瘍オルガノイドを添加した24ウェルプレートのオルガノイド培地に500 μLのコラゲナーゼ/ディスパーゼを加えます。基底膜マトリックスと培地を上下にピペットで動かします。37°Cで20分間インキュベートし、細胞を15 mLチューブに回収します><。 手記：基底膜マトリックスから単離されたオルガノイドを顕微鏡で調べます。オルガノイドが基底膜マトリックスから分離していない場合は、インキュベーション時間を長くするか、ピペットで回します。
2. 予熱したDMEMを5mL加え、チューブを400 x gで4°Cで3分間遠心分離し、上清を吸引します。
3. 予熱した0.25%トリプシン-EDTA1 mLと10 μM Y-27632を使用してペレットを再懸濁します。37°Cの水浴中で5分間インキュベートします。細胞を激しく上下にピペットで動かし、5mLのDMEMと10%FBSを使用してトリプシンを中和します。
4. チューブを400 x gで4°Cで3分間遠心分離し、上清を吸引します。
5. 1 mLの予熱したオルガノイド培地を使用してペレットを再懸濁し、単一腫瘍細胞の数をカウントします。

2. 膀胱オルガノイドの同所性移植(図1A)

1. 同所性移植のための膀胱腫瘍オルガノイドの調製
   1. 移植前に、上記のように膀胱腫瘍オルガノイドを5〜7日間培養します。
   2. 腫瘍オルガノイドを含む24ウェルプレートのオルガノイド培地に500 μLのコラゲナーゼ/ディスパーゼを加えます。基底膜マトリックスと培地をピペットで上下に動かします。37°Cで20分間インキュベートし、細胞を15 mLチューブに集めます。
   3. 予熱したDMEMを5 mL加え、チューブを400 x gで4°Cで3分間遠心分離し、上清を吸引します。
   4. ペレットを1mLのDMEMで再懸濁し、溶液を90mmのシャーレに移します。
   5. 顕微鏡下で、P200マイクロピペットを使用して10〜100個の腫瘍オルガノイドをピックアップし、氷上のマイクロチューブに収集します。
   6. チューブを400 x gで4°Cで3分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。
   7. マウスが手術の準備ができるまで、細胞ペレットを氷上に保ちます。
2. 粘膜下膀胱壁移植
   1. 実験の少なくとも1週間前に、8〜10週齢の雄のヌードマウス(CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl)を準備して、新しい環境に順応できるようにします。手術の24時間前にエンロフロキサシン(5 mg / kg)を皮下注射します。.
   2. ベンチの表面を石鹸と水できれいにします。外科的処置の前に手術器具をオートクレーブし、滅菌器具を使用して手術を行います。
   3. 29 Gインスリン注射器、ピペットチップ、および基底膜マトリックスを氷上に保ちます。麻酔の投与前にケトプロフェン(5 mg / kg)を皮下投与します。.
   4. 誘導チャンバー内でマウスを4%イソフルランで麻酔します。全身麻酔が達成されたら、マウスを仰臥位に置き、2%気化イソフルランのマスク吸入によって麻酔を維持します.
      手記：麻酔時間が30分を超える場合は、角膜の乾燥を避けるために、綿棒を使用して両目に眼軟膏を塗布します。
   5. 滅菌ガーゼでポビドンヨードを塗布し、70%エタノールで拭き取ります。毎回、新しいガーゼまたは綿棒で3回繰り返します。
   6. 肛門と手術野を使い捨ての滅菌外科用ドレープで覆います。
   7. 拡大用の解剖顕微鏡を使用して、滅菌手術用ハサミで下部正中線腹部の皮膚と筋肉壁に小さな横切開(1.5cm未満)を行います。腹腔から膀胱を露出させ、生理食塩水を染み込ませた綿棒で支えます.
      手記：膀胱が尿でいっぱいになっている場合は、膀胱をそっと押して少し減圧します。
   8. オルガノイドペレットを、50%高濃度の基底膜マトリックスを含むオルガノイド培地80 μLに再懸濁します(表1および材料表)。
   9. オルガノイド懸濁液を、29Gインスリンシリンジを用いて膀胱ドームの前面に注入し、解剖顕微鏡で行います。
   10. 腹壁の内層を抗菌吸収性縫合糸で閉じ、次に外層を4-0ナイロン縫合糸で閉じます。手術部位をポビドンヨードと70%エタノールで消毒します。
   11. 赤外線照射器の下でマウスが回復するのを10〜15分間待ちます。
   12. 手術の1日後、マウスの全身状態と吻合部の漏出を確認します。ケトプロフェン(5 mg / kg)を術後3日間1日1回投与し、エンロフロキサシン(5 mg / kg)を術後10日間1日1回治療します。.
   13. 切開部位が治癒したら(手術後10〜14日)、縫合糸を抜く。腫瘍オルガノイド注射後2〜3週間、マウス膀胱腫瘍の増殖をモニターします。
   14. 膀胱腫瘍の増殖が観察された場合は、二酸化炭素吸入を使用してマウスを安楽死させ、膀胱腫瘍全体を採取します。冷たいDPBSを使用して洗浄します(図1B)。
   15. 膀胱腫瘍の組織型を解析するには、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を使用して、組織のパラフィン包埋切片を染色します(図1B)。

マウス膀胱腫瘍オルガノイド培地
アドバンスドDMEM/F-12(ベーシックミディアム)	10 mM HEPES (pH 7.4)
10 mMニコチン酸アミド	0.5x 無血清サプリメント
2 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチド	1%ペニシリン/ストレプトマイシン
1 mM N-アセチル-L-システイン	50 ng/mL マウス上皮成長因子
1 μM A 83-01

表1:膀胱腫瘍オルガノイド培地の組成。

結果

図1:膀胱腫瘍オルガノイドの同所性移植。(A)膀胱腫瘍オルガノイドのヌードマウスへの同所性移植の概略図。(B)膀胱腫瘍オルガノイドを同所的に移植したマウスの膀胱およびH&E染色切片の代表的な画像。中央のパネルのボックス化された領域の拡大ビューは、左側のパネルに表示されます。スケールバー = 500 μm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mLコニカルチューブ	SPLの	50015
24ウェルプレート	コーニング	3526
29 G 1/2インスリン注射器	支那	B299473538
50 mLコニカルチューブ	SPLの	50050
A8301	トクリス	2939	原液濃度:25 mM
無水エタノール	テジョン	〒4023-2304
吸収性縫合糸	ヘンリー・シャイン	039010
アドバンスドDMEM/F-12	熱	12634028
CAnN.Cg-Foxn1nu/CRL (ヌードマウス)	チャールズ川	194
コラゲナーゼI型	熱	17100017	原液濃度:20 mg/mL
コラゲナーゼII型	熱	17100015	原液濃度:20 mg/mL
コラゲナーゼ/ディスパーゼ	シグマ	10269638001	ストック濃度:1 mg/mL
DMEM(ダルベッコの修正された最小必須メディア)	ギブコ	11965-118
DMSO(ジメチルスルホキシド)	シグマ	D8418
DPBS(ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)	ウェルジーン	LB 001-02
マトリゲル成長因子減少(GFR) 成長因子減少(GFR)	コーニング	354230	プレートでのオルガノイド培養に使用
マトリゲル高濃度(HC)	コーニング	354248	オルガノイド移植への使用
1.5 mLマイクロチューブ	アクシゲン	MCT-150-Cシリーズ
カミソリの刃
生理食塩水バッファー	JWファーマシューティカル
トリプシン-EDTA(0.25%)	ギブコ	25200072
超遠心チューブ	ベックマン・コールター	331372
Y-27632二塩酸塩	アブモール	M1817	ストック濃度:10 mM

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