固相マイクロ抽出サンプリング:グラフト組織からのサンプル抽出のためのプローブベースの手法

要約

出典:Stryjak, I. et al. Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、採取済みのドナー腎臓からの代謝物のSPMEプローブベースの抽出を実演します。抽出された代謝物は、移植のための臓器の質を評価するために、メタボロームおよびリピドミクス分析を行うために使用できます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. プローブの準備

1. チタン-ニッケル合金プローブ(長さ40 mm、直径0.2 mm)を7 mmミックスモード吸着剤でコーティングしたプローブを準備します。プローブの数は、手順全体で目標とする時点と反復回数によって異なります(各時点につき3回を推奨).
   手記：抽出フェーズの長さと種類は、研究モード、代謝物の極性、およびサンプルマトリックスに基づいて調整できます。
2. 2:1のクロロホルム:メタノール(v / v)で構成される洗浄混合物を準備します。溶液1.0mLを各2.0mLガラスバイアルにピペットで移し、事前にキャップに穴を開けたプローブを1つ、各バイアルに入れます
   手記：使用する前に、すべてのプローブを清掃して、汚染粒子を取り除
いてください。
3. バイアルを攪拌機に載せ、攪拌速度を1,200rpmに設定します。45分後、デバイスを停止し、コーティングをLC-MSグレードの水ですすいでください。
4. コーティングを活性化するにはプレコンディショニングステップを経る必要があるため、1:1メタノール:水(v / v)で構成されるプレコンディショニング混合物を準備します。2.0 mLガラスバイアル各1.0 mLの溶液にピペットで移し、キャップに穴を開けたプローブを1つずつ各バイアルに入れます。
5. バイアルをボルテックス攪拌機に載せ、攪拌速度を1,200rpmに設定します。
6. 60分後、攪拌機を停止し、コーティングをLC-MSグレードの水ですすいでください。
7. 標準的な手術器具の滅菌プロトコルに従ってプローブを滅菌します。

2. 抽出

1. 無菌環境を確保するために、サンプリングの直前に滅菌パッケージを開封してください。
2. 2つのプローブを腎臓皮質に直接挿入し、各時点で10分間挿入します。コーティングの全長は組織マトリックスで覆われている必要があります。角度は特に決まっていませんが、通常は約90°
   手記：医療処置全体は、特定の施設の標準的なプロトコルに従っています。SPMEサンプリングに関する変更は考慮されていません。この手順には、次の 6 つのサンプリング時間ポイントが含まれます: a) 腎臓切除前、ドナーから in vivo;b)–e)腎臓灌流の1時間後、3時間後、5時間後、7時間後、臓器室での生体外;f) 再灌流後、レシピエントからin vivoで。
3. プローブを組織から引き抜いて引っ込め、LC-MSグレードの水でコーティングをすすぎ、コーティング表面に残っている血液を取り除きます。手術部位から洗い流し、プローブを取り外した直後に洗い流してください。

>3. 輸送と保管

1. プローブを別々のバイアルに入れて閉じます。
2. ドライアイスで満たされた発泡スチロールの箱または液体窒素にバイアルを入れて輸送します。
3. サンプルは冷凍庫(-80°C)に保管するか、すぐに脱着ステップを開始してください。

4. 脱着

1. メタボローム解析用は80:20のアセトニトリル:水(v/v)、リピドミクス解析用の1:1イソプロパノール:メタノール(v/v)からなる脱離液を調製します。
2. 2.0 mLの標識バイアルに入れたインサートに溶液100 μLをピペットで移し、各バイアルにあらかじめキャップを貫通させたプローブを1つずつ入れます。
3. バイアルをボルテックス攪拌機に載せ、攪拌速度を1,200rpmで120分間設定します。
4. バイアルからプローブを取り出します。得られた抽出物は、機器分析の準備が整いました。

5. LC-MS分析

1. 抽出物を含むバイアルをLC-MSシステムのオートサンプラーに入れます.
   手記：この研究では、液体クロマトグラフィー(RP、HILIC)と高分解能質量分析計、およびOrbitrap質量分析計を併用しました。メタボローム解析パラメータについては、ステップ5.2に進みます。リピドミクス解析パラメータについては、ステップ 5.6 に進みます。
2. 逆相分離には、ペンタフルオロフェニル(PFP)カラム(2.1 mm × 100 mm、3 μm)を使用してください。
   1. 流速を300 μL/minに、オートサンプラーとカラムの温度をそれぞれ4°Cと25°Cに設定します。
   2. 移動相 A:水:ギ酸(99.9:0.1、v/v)、移動相 B:アセトニトリル:ギ酸(99.9:0.1、v/v)の割合で移動相を調製します。移動相の流れを次のパラメーターに従って設定します:移動相の流れの開始(0 〜 3 分):100% A に続いて 10% A への線形グラジエント(3 〜 25 分)、10% A のアイソクラティックな流れで 34 分まで終了し、その後 6 分間のカラム再平衡時間。
3. HILIC分離には、HILICカラム(2.0 mm x 100 mm、3 μm、200A)をご使用ください。流量を400μL/minに設定してください。
   1. 移動相A:アセトニトリル:酢酸アンモニウム緩衝液(9:1、v / v、有効塩濃度20 mM)、移動相B:アセトニトリル:酢酸アンモニウム緩衝液(1:1、v / v、有効塩濃度20 mM)。
   2. 移動相の流れを次のパラメータに従って設定します:移動相の流れ(0〜3分)を100%Aで開始し、3.0分間保持した後、5分以内に100%Bまでランプします。100%Bで12分間保持し、その後8分間のカラム再平衡時間を確保します。
4. スキャン範囲を85〜1000 m/zに設定し、ポジティブイオン化モードでのHESIイオン源パラメータをスプレー電圧1,500 V、キャピラリー温度300 °C、シースガス40 a.u.、補助ガス流量15 a.u.、プローブヒーター温度300 °C、S-Lens RFレベル55%に設定します。
5. 分析した各サンプル10 μLで構成されたQCサンプルを(定期的に、10〜12サンプルごとに)分析して、装置の性能を監視します。
6. 逆相分離には、C18 カラム(2.1 mm × 75 mm、3.5 μm)を使用します。
   1. 流速を 200 μL/min に、オートサンプラーとカラムの温度をそれぞれ 4 °C と 55 °C に設定します。移動相A:H₂O:MeOH(60:40、v / v)、10 mM酢酸アンモニウム、1 mM酢酸。移動相B:IPA:MeOH(90:10、v/v)、酢酸アンモニウム10 mM、酢酸1 mM
   2. 0–1 分(20% B)、1–1.5 分(20–50% B)、1.5–7.5 分(50–70% B)、7.5–13 分(70–95% B)、13–17 分(95% B)、17–17.1 分(95–20% B)、17.1–23 分(20%)のパラメーターに従って移動相流量を設定します。
7. HILIC分離には、HILICカラム(100 x 2.1 mm、3 μm)を使用します。
   1. 流速を400 μL/minに、オートサンプラーとカラムの温度をそれぞれ4°Cと40°Cに設定します。
   2. 移動相A:ACN、移動相B:5 mM酢酸アンモニウム水溶液の割合で、移動相を調製します。移動相の流量は、0 〜 2 分(96% B)、2 〜 15 分(96 〜 80 B)、15 〜 15.1 分(80 〜 96 % B)、15.1 〜 21 分(96 % B)のパラメーターに従って設定します。
8. ポジティブイオン化モードでのHESIイオン源パラメータをスプレー電圧3,500 V、キャピラリー温度275 °C、シースガス20 a.u.、補助ガス流量10 a.u.、プローブヒーター温度300 °C、S-Lens RFレベル55%に設定します。
9. 分析した各サンプル10 μL(10〜12サンプルごと)で構成されるQCサンプルを分析して、装置の性能をモニターします。
10. 機器と互換性のあるソフトウェアでデータ集録を実行します。

6. データ分析

1. ノンターゲットメタボロミクスおよびリピドミクス解析専用のソフトウェアを使用して、データ処理、推定同定、および統計解析を実行します.
   手記：主成分分析(PCA)とボックスウィスカープロットを取得して、データ構造を視覚化できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
酢酸	メルク	5330010050	移動相添加剤
アセトニ トリル	アルケム	696-34967-4X2.5L	HPLC溶媒
酢酸アンモニウム	メルク	5330040050	移動相添加剤
BENCHMIXER XL マルチチューブボルテクサー	ベンチマーク・サイエンティフィック	BV1010	ボルテックスミキサー
キャップ	Perlan Technologies(パーラン・テクノロジーズ)	〒5183-2076	ブルースクルーTP、スリット済みPTFE / Si SPTA、100PK
クロロホルム	メルク	1024441000
Discovery HS F5 Supelguard カートリッジ、3 μm、L × I.D. 2 cm × 2.1 mm	メルク	567570-U	HPLCガードカラム
Discovery HS F5、2.1 mm x 100 mm、3 μm	メルク	567502-U	HPLCカラム
蟻酸	アルケム	497-94318-50ミリリットル	移動相添加剤
ガラスバイアル	Perlan Technologies(パーラン・テクノロジーズ)	〒5182-0714
HILIC Luna 3 μm、200A、100 x 2.0 mm	シムポル	PHX-00D-4449-B0	HPLCカラム
HILIC SecurityGuard カートリッジ、3 μm、4 x 2.0 mm	シムポル	PHX-AJ0-8328	HPLCガードカラム
イソプロパノール	アルケム	231-AL03262500	HPLC溶媒
メタノール	アルケム	696-34966-4X2.5L	HPLC溶媒
ナノピュアウォーター	メルク	1037281002	HPLC溶媒
Q Exactive Focus 四重極-Orbitrap MS ハイブリッド	サーモサイエンティフィック	Q エクアクティブフォーカス	質量分析計
SeQuant ZIC-cHILIC 3μm,100Å 100 x 2.1 mm	メルク	1506570001	HPLCカラム
SeQuant ZIC-HILIC ガードキット 20 x 2.1 mm	メルク	1504360001	HPLCガードカラム
SPME LCファイバープローブ、ミックスモード	スペルコ	プロトタイプファイバー
UltiMate 3000 HPLCシステム	サーモサイエンティフィック	アルティメット3000	HPLCシステム
バイアルインサート(非アクティブ化)	Perlan Technologies(パーラン・テクノロジーズ)	〒5181-8872
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm	水	186005644	HPLCカラム
XSelect CSH C18 VanGuard カートリッジ 3.5μm, 2.1x5mm	水	186007811	HPLCガードカラム