細胞外DNA染色:FFPE組織切片中の細胞外DNAを同定する方法

要約

出典: O'Sullivan, K. M. et al. 糸球体腎炎における細胞外DNAの半定量化のための教師あり機械学習. J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、FFPE組織切片の細胞外DNAを染色する技術について説明しています。染色された細胞外DNAを定量して、がん細胞の死につながるあらゆる治療薬の有効性を判断できます。

プロトコル

1. DAPIおよびβ-ActinによるecDNAの染色

1. スライドガラスを60°Cオーブンのスライドラックに60分間入れます。
2. スライドを2種類の溶媒(キシレンまたは代替品)にそれぞれ40分間浸漬し、ドラフトチャンバーに入れます。
3. スライドを100%エタノール、100%エタノール、70%エタノールでそれぞれ5分間再水和します。水道水で5分間洗ってください。
4. ホットプレートをドラフトにセットし、抗原賦活化溶液(10 mM Tris、1 mM EDTA pH 9.0)を圧力鍋で事前に沸騰させます。抗原賦活化液が沸騰し始めたらすぐに、トングを使用してスライドを鍋に水平に置き、蓋をロックします。強火(15 psiまたは103 kPaに相当)で10分間煮沸
   手記：このステップは、抗原エピトープのマスクを解除(ホルマリン固定による架橋)することで目的の抗原を取り出し、エピトープ抗体特異的な結合を可能にするため、非常に重要です。その後の染色は、それなしでは機能しません。
5. 圧力鍋を火から下ろし、シンクの蓋の上部に冷たい蛇口を通してすぐに蓋を外します。スライドを抗原賦活化溶液中で20分間平衡化します。
6. オービタルシェーカー上の0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH 7.4)でスライドを5分間2回洗浄します。
7. 疎水性ペンを使用して、この間に組織が乾燥しないように注意しながら、腎臓組織の周りに円を描きます。
8. 5%ウシ血清アルブミン(BSA)/PBS(pH 7.4、0.01 M)中の10%ニワトリ血清中の組織を30分間、切片あたり60 μLでブロックします。このステップの後は洗わず、60μLのピペットを使用してブロッキング溶液を慎重に取り除き、切片を乾かさないでください。
9. 1% BSA/PBS(pH 7.4、0.01 M)、切片あたり60 μLで1/1000に希釈したβ-アクチンに一次抗体カクテルを適用し、4°Cの湿度チャンバーで一晩インキュベートします。
10. オービタルシェーカーでスライドをPBS(pH 7.4、0.01 M)で5分間2回洗浄します。
11. 二次抗体であるニワトリ抗ウサギ488(1/200)、1%BSA/PBS(pH 7.4、0.01 M)で希釈した切片60 μLを室温で40分間適用します。
12. オービタルシェーカーでスライドをPBS(pH 7.4、0.01 M)で5分間2回洗浄します。
13. スライドを70%エタノールの0.3%スーダンブラックに30分間Coplinジャーに浸します.
    手記：このステップは、ホルマリン固定によって引き起こされる自家蛍光を消光するため、重要です。
14. スライドを水道水で洗って沈殿物を取り除き、PBS(pH 7.4、0.01 M)に10分間浸して、スーダンブラックの沈殿物がさらに形成されるのを防ぎます。
15. DAPIを含む60μLの埋込液を3滴垂らして、スライドを共焦点ガラスカバースリップにマウントし、カバースリップの周囲に塗布してマニキュアでカバースリップを密封します。
16. スライドをRTで24時間硬化させ(DAPIを浸透させるため)、その後、光から保護された4°Cで保存します。
    手記：蛍光プローブの退色を防ぐために、暗所に保管することが重要です。
17. 顕微鏡に取り付けられた共焦点レーザースキャニングヘッドを使用して画像をスライドします。405 laser for DAPIと488 Laser for Beta ActinでスライドをExciteします。ecDNAの検出に不可欠なラインシーケンシャルキャプチャと4ライン平均化を使用して、1024 x 1024ピクセルの単一平面画像をキャプチャします。40x 1.0 NAオイル対物レンズを使用。
    1. サンプルあたり最低20個の糸球体を画像化します。画像をND2ファイルとして保存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ血清アルブミン	シグマ	A2153の	5%と1%の溶液はPBSで作られており、バルクで作って冷凍することができます-解凍したら廃棄します
ニワトリ抗ヤギIgG(H + L)交差吸収抗体Alexa Fluor 594	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-21468	使用前にミニ遠心分離機で1分間遠心して、抗体カクテルに遊離結合が入らないように
ニワトリ抗マウスIgG(H+L)交差吸収抗体、Alex Fluor 647	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-121468	使用前にミニ遠心分離機で1分間遠心して、抗体カクテルに遊離結合が入らないように
ニワトリ抗ウサギIgG(H + L)交差吸収抗体Alexa Fluor 488	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-21441	使用前にミニ遠心分離機で1分間遠心して、抗体カクテルに遊離結合が入らないように
チキンセラ	シグマ	C5405	1%BSA / PBSで構成
カバースリップ 24x60 mm	アゼルサイエンティフィック	ES0107222	#1.5 これは、共焦点顕微鏡で使用するために設計された標準的な厚さではありません
EDTAの10mM	シグマ	E6758	TRISとEDTAを蒸留水に一緒に加え、抗原賦活化のためにpHを9にすると、10倍溶液で調製できます
エタノール30%、70%、100%	ケムサプライ	UN1170	100%非変性エタノールとして供給 - 蒸留水を使用して30%と70%に希釈
ホルムアルデヒド、4%(10%中性緩衝ホルマリン)	トラヤヌス	NBF-500	腎臓は、RTで16時間ホルマリンの3mlを含む5mlチューブに入れられ、ホルマリンはヒュームフードで使用する必要があります
ガラス組織学スライド - ウルトラスーパーフロスト、メンゼルグレーズ、25x75 x1.0mm	トラヤヌス	J3800AM4	正に帯電したコーティングされたスライドの使用は不可欠です。抗原賦活化ステップ中に組織がスライドから剥がれるため、スライドのコーティングにポリ-L-リジンを使用することはお勧めしません
ヤギ抗ヒト/マウスMPO抗体	研究開発	AF3667	到着時にアリコートしてマイナス80度で凍結
疎水性ペン	ベクターラボ	H-400	腎臓組織の周りに円を描くために使用します
リン酸緩衝生理食塩水	シグマ	P38135	0.01M PB/0.09% NaCl 一度に5Lを構成
圧力鍋 6L ティファール セキュア5 ネオステンレス	ティファール	GSA-P2530738	地元の家庭用品店で購入
ロングゴールドDAPI	ライフテクノロジー	P36962	カバーガラスに直接滴を塗ります
ウサギ抗ヒト/マウスβアクチン抗体	ABCAMの	AB8227	到着時にアリコートしてマイナス80度で凍結
ウサギ抗ヒト/マウスH3Cit抗体	ABCAMの	AB5103	到着時にアリコートしてマイナス80度で凍結
染色ラック スライド24	プロサイテック	H4465-J	選択した染色ラックは、圧力下での沸騰と60度のオーブンでのインキュベーションに耐えることができなければなりません
スーダンブラックB	シグマ	199664	0.3%70%エタノールで1Lボトルに3gを加え、ろ過して光から保護します-室温で6か月間安定します
トリス 10mM	シグマ	T4661	TRISとEDTAを蒸留水に一緒に加え、抗原賦活化のためにpHを9にすると、10倍溶液で調製できます
キシレン	トラヤヌス	XL005/20	ヒュームフードで使用する必要があります