人工多能性幹細胞からのヒト腎臓足細胞の誘導:幹細胞からの成熟腎臓足細胞の指向性分化のための手順

要約

出典:Burt, M. et al.化学的に定義された条件下でのヒト人工多能性幹細胞からの成熟腎臓足細胞のガイド付き分化。J. Vis. Exp. (2020年)

このビデオでは、人工多能性幹細胞から、定義された化学的条件下での細胞分化を通じてヒト腎臓足細胞を誘導するプロトコルについて説明します。生成された有足細胞は、腎毒性試験や疾患モデリングに使用できます。

プロトコル

1. 試薬の調製

1. 解凍した5倍hiPS細胞培養培地(CCM)サプリメントをhiPS細胞培養基礎培地で希釈して、hiPS CCMの1倍溶液を得る
   手記：冷凍5x hiPS CCMサプリメントは、ゆっくりとした解凍プロセスが必要で、理想的には4°Cで一晩中解凍する必要があります。1x hiPS CCMのアリコートは、-20°Cで最大6ヶ月間保存できます。
2. hiPS細胞培養用の基底膜(BM)マトリックス1コーティングプレートの調製:BMマトリックス1を氷上で4°Cで一晩解凍します。解凍後、メーカーが推奨する適切な希釈係数でアリコートを調製します。
   手記：通常、アリコートは、50 mLのコニカルチューブ内の25 mLの冷たいDMEM/F12で希釈するために調製され、その後、BMマトリックス1を完全に溶解し、残留結晶の形成を避けるために完全に混合されます。
3. 1 mLのBMマトリックス1溶液を6ウェルプレートの各ウェルに移し、パラフィンフィルムで包んだ状態で、37°Cで1〜2時間、または4°Cで最低24時間インキュベートします。BMマトリックス1コーティングプレートは、4°Cで最大2週間保存できます。
4. 基底膜(BM)マトリックス2コーティングプレートの調製:適切な量のBMマトリックス2を9mLの滅菌蒸留水で希釈して、最終濃度5μg/mLを調製します。12ウェルプレートの各ウェルに700 μLのBMマトリックス2溶液を加え、プレートを室温で2時間または4°Cで一晩インキュベートします。
5. BMP7、アクチビンA、およびVEGFのそれぞれ100μg / mLのストック溶液を次のように調製します:0.1%(wt / vol)BSAを含む滅菌蒸留水でBMP7を再構成し、0.1%(w t / vol)BSAを含む滅菌PBSでアクチビンAとVEGFを別々に再構成します。凍結融解のサイクルを頻繁に繰り返さないように、各ストック溶液から100 μLのアリコートを調製し、-20°Cで最大6か月間保存します。
6. 10 mgのY27632を3.079 mLの滅菌蒸留水に溶解して、Y27632の10 mM原液を調製します。ストックから100 μLを分量し、-20°Cで最大6か月間保存します。
7. 2 mgのCHIR99021を143.4 μLの滅菌DMSOに溶解して、30 mMのストック溶液を調製します。5 μLのアリコートを調製し、-20°Cで最大1か月間(またはメーカーの推奨に従って)保存します。
8. 10 mgのオールトランスレチノイン酸を3.33 mLの滅菌DMSOに溶解します。.500 μLのアリコートを調製し、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。

2. 培地の準備

1. 対応するストック溶液を最終濃度100 ng/mL Activin A、3 μM CHIR99021、10 μM Y27632、および1x B27無血清サプリメントに適量のDMEM/12にグルタミンサプリメントと共に再溶解することにより、中胚葉分化培地を調製します
   手記：中胚葉分化培地は、分化ステップの前に、実験の規模に適した量で新たに調製する必要があります(通常、2枚の12ウェルプレートには50 mLの培地で十分です)。
2. 対応するストック溶液を最終濃度100 ng/mL BMP7、3 μM CHIR99021、およびDMEM/F12中の1x B27無血清サプリメントにグルタミンサプリメントで再溶解することにより、中間中胚葉分化培地を調製します
   手記：必要に応じて、培地に1%(vol / vol)ペニシリン-ストレプトマイシンを補充できます。.DMEM/F12とグルタミンサプリメントを使用して、培地の量を調整します。この培地は、大量のバッチで調製できます。ただし、凍結融解サイクルの繰り返しを避けるために、より小さなアリコート(たとえば、50 mLコニカルチューブに45 mL)で保管することをお勧めします。この培地は、-20°Cで最大3ヶ月間保存でき、使用前に4°Cで一晩解凍できます。
最終
3. 濃度 100 ng/mL BMP7、100 ng/mL アクチビン A、50 ng/mL VEGF、3 μM CHIR99021、1x B27 無血清サプリメント、および 0.1 μM オールトランスレチノイン酸 DMEM/F12 とグルタミンサプリメントに再構成して、足細胞誘導培地を調製します。媒体を光から保護します(例:箔紙で容器を包む).
   手記：この培地は、大量のバッチで調製でき、-20°Cの暗所で最大3か月間保存できます。冷凍アリコートは、使用前に4°Cで一晩解凍する必要があります。
4. DMEM/F12に10%(vol / vol)の熱不活化FBSを加えて25mLのトリプシン中和液を調製し、滅菌条件下でろ過します。
5. 幹細胞由来有足細胞の分化後維持のために、メーカーのガイドラインに従って基礎培地にサプリメントを添加して有足細胞維持培地を含むComplete Mediumを調製し、4°Cで最大2週間保存します。

>3. hiPS細胞培養液を用いたフィーダーフリーhiPS細胞培養

1. プレコートプレートからBMマトリックス1の残留溶液を吸引し、ウェルを1〜2mLの加温DMEM/F12で3回洗浄します。
2. hiPS細胞から使用済みのhiPS CCMを吸引し、温めたDMEM/F12で細胞を3回すすぎます。1 mLの温かい細胞剥離溶液を加え、37°Cで1分間インキュベートして細胞の解離を助けます。組織培養顕微鏡で細胞の目視検査を行い、細胞コロニーのエッジが丸みを帯びて見えることを確認してから、細胞から細胞剥離溶液を迅速に吸引します(細胞コロニーが緩いですが、プレートにまだ付着していることを確認します)。DMEM/F12で細胞を一度穏やかにすすぎ、細胞剥離液を除去します。
3. 細胞剥離溶液で処理したhiPS細胞(6ウェルプレートの各ウェル内)に3 mLのhiPS CCMを加えます。セルリフターを使用してコロニーをこすり落とし、細胞懸濁液を上下に静かにピペットで動かして、緩く付着した細胞を取り除きます。プレートをよく洗って、すべての細胞が採取されていることを確認します.
   手記：細胞の過剰なせん断を避けるために、5mLピペットの使用をお勧めします。
4. 0.5 mLの細胞懸濁液を、ウェルあたり2 mLのhiPS CCMを含む新しいBMマトリックス1コーティング6ウェルプレートの各ウェルに移します。プレートを8の字型に動かしてウェル内に細胞コロニーを分布させ、5 % CO₂インキュベーターで37°Cでインキュベートします。細胞を継代する準備が整うまで、または分化実験に使用する準備ができるまで、培地を毎日更新します(約70%のコンフルエント度)
   手記：iPS細胞のルーチン継代に理想的なコロニーサイズは、hiPS CCM(ROCK阻害剤なし)を使用したフィーダーフリー条件下で200〜500μmです。解離酵素またはバッファーによる処理中に細胞を個別化する場合、hiPS CCMにROCK阻害剤(例:10 μM Y27632)を補充して、細胞生存率を向上させることができます。

4. hiPS細胞の中胚葉細胞への分化(0-2日目)

1. hiPS細胞培養物が指数関数的増殖期(継代後約4日以内、約70%のコンフルエント)にある間に、コロニー内およびコロニー周辺に自発分化細胞が存在することを目視で確認します。必要に応じて、差別化された領域を無菌的に削り取ります。
2. hiPS細胞からhiPS CCMを吸引し、温かいDMEM/F12で細胞を3回すすぎます。酵素を含まない細胞解離バッファー1 mLと37°Cで10分間インキュベートし、顕微鏡で解離を確認します。異なるhiPS細胞株間に固有の違いがあるため、細胞解離バッファーの実際のインキュベーション時間は、特定の細胞株について決定する必要があります。
3. セルリフターでウェルをやさしくこすり落とし、緩く付着した細胞を取り除き、細胞懸濁液を15mLのコニカルチューブに移した後、数回ピペッティングで上下させてhiPS細胞を個別化します。
   1. 細胞懸濁液を温かいDMEM/F12で15 mLの容量に戻し、室温で290 x gで5分間遠心分離します。
   2. 上清を穏やかに吸引し、温かいDMEM/F12で細胞を再懸濁して、残留BMマトリックス1および解離バッファー成分を除去するための遠心分離
   を再度行います。
4. 上清を吸引し、上記のように細胞を1mLの中胚葉誘導培地に再懸濁します。血球計算盤またはコールターカウンターを使用して細胞の総数をカウントし、1 x 10⁵細胞/mLの濃度を達成するために必要な中胚葉分化培地の適切な量を決定します。
5. BM matrix 2コーティングプレートからECM溶液を吸引し、温かいDMEM/F12でプレートを2回すすぎます。hiPS細胞懸濁液を数回ピペッティングして穏やかに混合します。1 mLの細胞懸濁液をBMマトリックス2コーティング12ウェルプレートの各ウェルに移し、プレートを穏やかに振とうして細胞をより均一に分配します。
6. プレートを37°Cで5%_CO2インキュベーターでインキュベートします。翌日、中胚葉誘導培地をリフレッシュします.
   手記：2日後、hiPS細胞由来中胚葉細胞は中間中胚葉誘導の準備が整います。

5. hiPS細胞由来中胚葉細胞の中間中胚葉への分化(2-16日目)

1. 分化プロトコルの 2 日目に、中胚葉誘導培地を吸引し、ウェル中間中胚葉誘導培地 1 mL を補充します。
2. 培地を毎日リフレッシュして、代謝活性細胞の成長因子と小分子の正確な閾値を維持します。細胞の増殖が著しく、培地の栄養素が急速に枯渇している場合(培地の黄変によって示されます)、中間中胚葉分化培地の容量を12ウェルプレートのウェルあたり1.3 mLに増やすことができます。
3. 細胞をさらに14日間培養して、中間中胚葉細胞を取得します。16日目までに、これらの細胞は後で使用するために凍結保存することができます。

>6. hiPS細胞由来中胚葉細胞のポドサイトへの分化(16-21日目)

1. 中間中胚葉細胞を温かいDMEM/F12ですすいでください、続いて0.05 % トリプシン-EDTAのウェルあたり0.5 mLで細胞をインキュベートし、37°Cで3分間、細胞が解離し始めていることを確認するために目視検査を行います。
2. Cell Lifterを使用して細胞を掻き取り、1,000 μLのピペットチップを使用して細胞懸濁液を数回ピペットで動かし、個別化された(または小さな塊の)細胞を取得します
   手記：この段階では、凝集した細胞がプロトコルのタイムライン内で最終分化した表現型を取得できない可能性があるため、細胞が完全に解離
していることを確認してください。
3. トリプシンの活動を停止するために、トリプシン中和溶液のウェルあたり約2mLを追加します。
4. 細胞を50 mLのコニカルチューブに移し、DMEM/F12を使用して容量を最大50 mLにした後、細胞懸濁液を室温で201 x gで5分間遠心分離します。
5. 上清を吸引し、足細胞誘導培地に細胞を再懸濁します。最適な結果を得るには、12ウェルプレートの最終的な播種密度を約100,000細胞/ウェルにしてください。細胞懸濁液をBMマトリックス2コーティングプレートに加え、プレートを静かに振とうして、細胞がより均一に分布するようにします。
6. 細胞を37°Cおよび5%_CO2でインキュベートし、培地を最大5日間毎日リフレッシュして、21.
   日までに足細胞を取得します 手記：得られたhiPS細胞由来の有足細胞は、有足細胞維持培地を含む完全培地を使用することで、さらに2〜4週間培養に維持することができます。有足細胞維持培地に入れたら、細胞を隔日で供給することができ、その後の研究や下流の分析に使用できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞
DU11ヒトiPS細胞			DU11(Duke University clone #11) iPS細胞株は、デューク大学のiPS細胞コア施設で作製され、デューク大学のBursac Labから提供されました。この系統はマイコプラズマについて試験され、2019年7月に当研究室で最後に核型が決定され、核型が正常であることがわかりました。
成長因子と培地サプリメント
オールトランスレチノイン酸(500mg)	72262	幹細胞技術
B27無血清サプリメント	17504044	サーモ/ライフテクノロジー
CHIR99021	04-0004	ステムジェント	ロット間のばらつきが見られる場合があります
コンプリートミディアムキット 付き カルチャーブースト-R	4Z0-500-R	細胞システム	ポドサイト維持培地
DMEM/F12	12634028	サーモ/ライフテクノロジー
DMEM/F12 と GlutaMAX サプリメント	10565042	サーモ/ライフテクノロジー	DMEM/F12 とグルタミンサプリメント
ヒートインアクティベートFBS	10082147	サーモ/ライフテクノロジー
ヒトアクチビンA	PHC9564	サーモ/ライフテクノロジー
ヒューマンBMP7	PHC9544	サーモ/ライフテクノロジー
ヒトVEGF	PHC9394	サーモ/ライフテクノロジー
mTeSR1 ミディアム	05850	幹細胞技術	hiPS細胞培養培地(CCM)
ペニシリン-ストレプトマイシン、液体 (100×)	15140-163	サーモ/ライフテクノロジー
Y27632 ROCK阻害剤	1254	トクリス
抗体
Alexa Fluor 488およびAlexa Fluor 594標識二次抗体	A32744;A32754;A-11076;A32790の	サーモ/ライフテクノロジー
ブラチュリー(T)	AB20680	アブカム
ネフリン	GP-N2	プロジェイン
10月4	AF1759	R&Dシステム
PAX2 (パックス2	71〜6000	インビトゲン
WT1	MAB4234	ミリポア
ECM分子
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) フラグメント	N-892012	岩井北米	基底膜(BM)マトリックス2
マトリゲル hESC 認定マトリックス、5 mL バイアル	354277	BDバイオサイエンス	基底膜(BM)マトリックス1。ロット間のばらつきが見られる場合があります
酵素およびその他の試薬
アキュターゼ	A1110501	サーモ/ライフテクノロジー	細胞剥離ソリューション
BSAの	A9418の	シグマ・アルドリッチ
ジメチルスルホキシド(DMSO)	D2438	シグマ・アルドリッチ	DMSOは有毒です。化学安全フードで取り扱う必要があります
酵素フリー細胞解離バッファー、ハンクバランス塩	13150016	サーモ/ライフテクノロジー
エタノール溶液、70%(vol/vol)、バイオテクノロジーグレード	〒97065-058	VWRの	エタノールは可燃性で有毒です
FBSの	431097	コーニング
パラホルムアルデヒド(PFA)	28906	サーモ/ライフテクノロジー	PFAは、手袋、白衣、安全眼鏡などの適切な個人用保護具を備えた化学ドラフトで取り扱う必要があります。吸入や皮膚との接触を避けてください。
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	14190から250	サーモ/ライフテクノロジー
滅菌蒸留水	15230162	サーモ/ライフテクノロジー
トリトンX-100	〒97062-208	VWRの
トリプシン-EDTA、0.05%	25300から120	サーモ/ライフテクノロジー
備品
吸引ピペット、個別包装	29442-462	コーニング
Avanti J-15R 遠心分離機	B99516	ベックマン・コールター
円錐形遠心チューブ、15 mL	352097	コーニング
円錐形遠心チューブ、50 mL	352098	コーニング
クライオボックス	3395465	サーモ/ライフテクノロジー	冷凍アリコートの保存に
エボスM7000	AMF7000	サーモ/ライフテクノロジー	固定・染色したiPS細胞とその誘導体の画像を取得する蛍光顕微鏡
血球計算盤	100503から092	VWRの
Heracell VIOS 160i CO2 インキュベーター	51030403	サーモ/ライフテクノロジー	iPS細胞およびその誘導体の日常的な培養とメンテナンスに
AxioCam 503カメラを搭載した倒立型Zeiss Axio Observer	491916-0001-000(顕微鏡); 426558-0000-000(カメラ)	カールツァイス顕微鏡	足細胞の分化の各段階における生iPS細胞およびその誘導体の位相コントラスト画像を取得するために使用
Kimberly-Clarkニトリル手袋	40101-346	VWRの
キムワイプ、大	21905-049	VWRの
キムワイプ、小	21905-026	VWRの
P10精密バリアピペットチップ	P1096-FR	デンビルサイエンティフィック
P100バリアピペットチップ	P1125	デンビルサイエンティフィック
P1000バリアピペットチップ	P1126	デンビルサイエンティフィック
P20バリアピペットチップ	P1121	デンビルサイエンティフィック
P200バリアピペットチップ	P1122	デンビルサイエンティフィック
血清ピペット、10 mL、個包装	356551	コーニング
血清ピペット、25 mL、個別包装	356525	コーニング
血清ピペット、5 mL、個包装	356543	コーニング
ステリフリップ、0.22 μm、PES	SCGP00525	EMDミリポア
滅菌マイクロ遠心チューブ	1138W14	トーマス・サイエンティフィック	成長因子の分注に
組織培養処理済み 12 ウェルプレート	353043	コーニング
組織培養処理 6 ウェルプレート	353046	コーニング
VWRホワイトテチュニ白衣	10141-342	VWRの
幅広開先セルリフター	3008	コーニング

名 の 日 ) 形 シリーズ の 年