排尿筋平滑筋細胞の単離:ヒト膀胱標本からDSM細胞を得るための酵素消化手順

要約

出典:Malysz, J. et al.9-フェナントロール感受性陽イオン電流の特性評価のための新たに単離されたヒト排尿筋平滑筋細胞の調製と利用。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、2段階の連続酵素処理を使用して、ヒトの膀胱標本から排尿筋平滑筋細胞を分離する方法を示します。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. DSM組織の解剖と粘膜を含まないDSMピースの調製

1. 手術室から実験室に到着した全層の膀胱検体を、冷たい解剖/消化液で満たされた密閉容器に入れて検査します(DSの組成については図1と表1)
   手記：検体は通常、実験室に到着する前に数時間から一晩まで低温DSに保管されます。より長期保存するために、DS(表1)に1 mM CaCl₂を添加します。
2. ヒト全層DSM標本(粘膜、DSM、血清腫を含むすべての層を含む)を氷冷DSで取り外してすすぎ、付着した破片や血液を洗い流します。
3. 粘膜が上を向き、漿膜が下を向いている膀胱標本を、氷冷したDSで満たされた直径150mmのシリコンエナンチオマーコーティング(材料表)の丸皿にピンで留めます(図1B)。
4. 隣接する脂肪組織、血管、上皮(尿路上皮)、粘膜筋をマイクロハサミや鉗子を用いて鋭く解剖し、標本から取り除きます。
5. 粘膜のないDSM片(長さ~2〜3 mm、幅4〜6 mm)を数個切り取ります(図1C)。

2. DSM断片の酵素解離により、新たに単離された単一DSM細胞が得られる

1. パパインとジチオスレイトールを含む1〜2 mLの予熱済み(~37°C)DSが入ったチューブに3〜6個のDSMピースを入れ(DS-P、表1)、DSMピースをDS-Pで~37°Cで30〜45分間インキュベートします。チューブを時々(10〜15分に1回)穏やかに振とうします
   手記： 酵素治療の温度を最適に制御するために、組織片と酵素溶液の入ったチューブを、循環加熱水浴に接続された水で満たされたガラス組織チャンバー(図1D)または高精度の温度制御された振とう水浴(図1E)のいずれかに配置します。
2. DS-Pをチューブから取り外し、DSMピースを氷冷DSで短時間洗い、チューブから冷たいDSを捨てて、DSMピースをチューブの底に座らせます。
3. DSMピースを入れたチューブにDS含有コラゲナーゼII型(DS-C、表1)1〜2 mLを加え、チューブを時々(10〜15分おきに)穏やかに振とうしながら、~37°Cで25〜40分間静かに混合し、インキュベー
トします。
4. DS-Cを廃棄し、酵素処理したDSMピースを氷冷したDSで5〜10回洗浄します。
5. 最後の洗浄後、DS溶液をチューブ内に入れ、ファイヤーポリッシュしたパスツールピペットで数回静かに粉砕し、単一のDSM細胞を放出します。
6. 分散したDSM細胞を含むDS溶液をガラス底チャンバーまたはカバーガラスに数滴垂らし、塗布後少なくとも5分後に顕微鏡下(20倍または40倍対物レンズを使用)で品質を目視検査し、細胞が底部に付着することを確認します。
7. 電気生理学的実験のために新たに分離されたDSM細胞を直ちに使用するか、DSを含むチューブにDSを含むチューブを氷上または冷蔵庫で保存し、使用まで(通常は最大8時間の調製)
   手記：同じ調製物内で、細胞の品質は、生存率の高いものから過剰に消化された死んだDSM細胞までさまざまです(図2)。シーケンシャルパパイン-コラゲナーゼ法で非常に多くの生存不能細胞が生成された場合、調製物は廃棄され、DSM断片の新たな消化が行われますが、インキュベーション間隔は短縮されます。この手順の結果、DSM細胞が少なすぎる場合は、その後のDSM断片の消化のために、インキュベーション間隔が長くなります。α平滑筋アクチンに対する免疫反応性が陽性であることから、DSM細胞の同一性が確認されています(図3)。

ソリューションの種類	組成(mM)
DS(解剖/消化液)	80 Na-グルタミン酸、55 NaCl、6 KCl、10 HEPES、2 MgCl2、11 グルコース、pH 7.4 に調整 (10 M NaOH)
DS-P(パパイン含有DS)	1-2 mg/ml パパイン、1 mg/ml ジチオスレイトール、1 mg/ml ウシ血清アルブミンを含む DS
DS-C(コラゲナーゼ含有DS)	1-2 mg/ml コラゲナーゼ II 型、1 mg/ml ウシ血清アルブミン、0 または 1 mg/ml トリプシン阻害剤、100-200 μM Ca2+ を含む DS 溶液
P(ピペット)	110 CsOH、110 アスパラギン酸、10 NaCl、1 MgCl2、10 HEPES、0.05 EGTA、および30 CsCl、pHを7.2に調整し、CsOHで、アムホテリシン-B(300-500 μg/mL)を添加
E(細胞外)	10 塩化テトラエチルアンモニウム (TEA)、6 CsCl、124 NaCl、1 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES、および 10 グルコース、pH を 7.3-7.4 に調整し、NaOH または CsOH、および 0.002-3 (2-3 mM) ニフェジピン

表1:穿孔パッチクランプ実験で使用した解剖/消化液(DS)、ピペット溶液、細胞外溶液の組成。

結果

図1:排尿筋平滑筋(DSM)片の調製と酵素解離に使用されるセットアップの解剖手順の要約。示されているのは、(A)氷のように冷たいDSの外部手術材料として開放膀胱手術から提供された全層のヒト膀胱標本、(B)部分的に解剖されたDSM層でピン留めした後の同じ調製物、(C)DSM層から切り出された可変寸法のDSM片で、酵素消化(小さい部分)または他の実験的調査(大きい部分)の準備ができています。 (D、E)DSMピースの酵素消化に使用される代替セットアップは、(1)チューブを介して水で満たされた大きなガラス組織チャンバーに接続された温度制御循環水浴、チューブ用のゴムホルダー、DSMピースと解剖/消化溶液で調製された酵素溶液を含むプラスチ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5mlポリスチレン丸底チューブ	隼	352054	消化ステップで使用される酵素を含むDS用チューブ
アナログボルテックスミキサー	VWRの	58816から121
ウシ血清アルブミン	シグマ・アルドリッチ	A7906	ダッシー
塩化カルシウム	シグマ・アルドリッチ	C1016	細胞外溶液とDS
エグタ	シグマ・アルドリッチ	E3889	Ca2+キレート剤、細胞内ピペット溶液に使用
グルコース	シグマ	G8270
コラゲナーゼ2型	ワージントン・バイオケミカル・コーポレーション	LS004177	DS-Cの
水酸化セシウム水和物	シグマ・アルドリッチ	C8518	細胞内ピペット溶液
セシCl	シグマ・アルドリッチ	203025	細胞外および細胞内ソリューション
DL-ジチオスレイトール(DDT)	シグマ・アルドリッチ	D9779	還元剤とパパインの併用
NaOH	シグマ・アルドリッチ	S8045
ニフェジピン	シグマ・アルドリッチ	N7634	L型電位依存性Ca2+チャネルブロッカ
フローティングフォームチューブラック/ホルダー	VWRサイエンティフィック	82017-634	温度制御のための酵素入りチューブの保持に使用
グルタミン酸(Na塩)	シグマ・アルドリッチ	G1626	ダッシー
パパイン	ワージントン・バイオケミカル・コーポレーション	LS003126	DS-P
MgCl2(六水和物)	シグマ・アルドリッチ	M2670	細胞外および細胞内ソリューション
KClの	フィッシャーサイエンティフィック	BP366-1	細胞外溶液
NaCl	シグマ・アルドリッチ	S7653	細胞外および細胞内ソリューション
非金属シリンジ針、MicroFil	WPIの	MF-34G-5	細胞内ピペット溶液の充填
パスツールピペット	フィッシャーブランド	13-678-20A	チップを折ってファイヤーポリッシュし、酵素処理された組織の滴定に使用され、ピースから単一のDSM細胞を放出します
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H3375-J	pHバッファー
Thermo Scientific Precision 振とうウォーターバス(モデル 2870)	サーモサイエンティフィック	中止	ティッシュチャンバー循環槽の代替として採用された酵素消化の温度制御のためのウォーターバス
ビニールチューブ	コールパーマー	06405-3	ティッシュバスを循環水バスに接続するなど、複数の用途があります
循環式水栓 Haake D1 L	ハーケ	中止	ティッシュバスに接続
ZeissAxiovert 40C 倒立顕微鏡 (10x および 40x 対物レンズ付き	カールツァイス	中止	パッチクランプリグセットアップの一部

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