アンホテリシン-B媒介穿孔パッチクランプ分析:膀胱細胞のイオン電流を研究するための電気生理学的手法

Abstract

出典:Malysz, J. et al.9-フェナントロール感受性陽イオン電流の特性評価のための新たに単離されたヒト排尿筋平滑筋細胞の調製と利用。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオは、アムホテリシンB媒介穿孔パッチクランプ技術を使用して、排尿筋平滑筋細胞の一過性受容体電位メラスタチン4型(TRPM4)イオンチャネルからのカチオン性電流の特性評価を示しています。この技術は、イオンチャネルの生物物理学的および薬理学的特性の評価に役立ちます。

Protocol

1. アムホテリシンB全細胞電圧パッチクランプ法を用いたDSM細胞からの電圧ステップ誘起陽イオン電流の記録

1. 倒立顕微鏡のステージに座っているガラス底チャンバーに0.25〜1 mLの細胞懸濁液をピペットで移し、細胞をガラス底に接着させます。
2. 少なくとも45分間インキュベートした後、消化液(DS)を槽から取り出し、E溶液(表1)と交換します。これは、入口チューブを介した重力支援溶液の流れがDSをゆっくりと新しい溶液に置き換え、真空廃棄物容器に接続された出口チューブがチャンバー溶液を除去し、オーバーフローを防ぎます
   手記：E溶液には、テトラエチルアンモニウム(TEA⁺)イオンとセシウム(Cs⁺)イオンが含まれており、K⁺電流を抑制します。
3. ジメチルスルホキシド(DMSO)中のアムホテリシン-Bの作業用ストック溶液を調製します(DMSO10μLあたり1mg)。アンホテリシン粉末を完全に溶解するには、超音波処理(少なくとも15分)し、溶液をよくボルテックスします
   手記：このステップは通常10分未満で完了します。1.5 mLの微量遠心チューブで30〜40 μLのDSMOに3〜4 mgのアムホテリシンBを溶解すると、うまく機能します。アンホテリシン-Bの量が多いほど、より多くのDSMO溶媒が必要になるため、通常、チューブ内に存在するアンホテリシンB固体粒子の混合間隔が長くなり、不完全な可溶化
が生じます。
4. アムホテリシン-Bのストック溶液をピペット溶液(溶液P、表1)に溶解して、最終濃度200〜500 μg/mLを得ます。このステップでは、ピペット溶液中のアムホテリシン-B沈殿物の形成を最適に混合し、防止するために、ステップあたり30~60分間、高速設定(8-10/10)で広範な超音波処理とボルテックスを行う必要があります
   手記：アムホテリシン-Bは時間の経過とともに沈殿し、光感受性を示します。アムホテリシン-Bを含む作業用ピペット溶液は、溶解性をチェックし、ピペット充填前に手で混合し、暗所に保管します。
5. 複数のパッチ電極を引っ張り、電極の先端をファイヤーポリッシュし、(必要に応じて)先端を歯科用ワックスでコーティングします。
6. アンホテリシン-Bを含まないピペット溶液(溶液P、表1)でパッチ電極の先端を充填し、電極を溶液に短時間浸します。
7. アンホテリシン-Bを含む同じピペット溶液で電極を埋め戻します。
8. 電極をパッチクランプに接続されたホルダーに取り付けますamp ヘッドステージ。
9. マイクロマニピュレータを使用して、電極の先端がちょうど水没するように、電極を細胞外溶液の表面のすぐ下に配置します。
10. 電圧クランプモードでは、保持電位を0mVに設定し、市販のアンプのピペットオフセットダイヤルで電流を0pAに調整します(材料表)。
11. 商用取得ソフトウェアのMembrane Test window/機能を使用して電極抵抗を決定します(Table of Materials)。有効にするには、[ツール]>[膜テスト>再生]をクリックするか、ソフトウェアのショートカットアイコンをクリックします。決定された電極抵抗は、2〜5MΩの範囲である必要があります。
    手記：市販のアクイジションソフトウェアまたはアンプのシールテストオプションに用意されているメンブレンテスト機能を使用して、電圧ステップを繰り返し印加することにより電極抵抗を監視できます。
12. 電極抵抗のモニタリングを継続しながら、マイクロマニピュレータを使用して選択したDSMセルに向かって電極を進めます(図1A).
    手記：生存可能なDSM細胞と見なされるには、細胞は紡錘形の細長い形態、細胞の周囲にはっきりとしたハロー、鮮明なエッジ、および半収縮性(蛇行)の外観を示す必要があります。
13. 電極で細胞表面に触れると(メンブレンテスト機能で測定した電極抵抗が急激に増加する)、チューブを介して電極ホルダーに緩やかで急速な負圧を加えることでギガシールを形成します。これにより、電極の先端に負圧が発生し、細胞膜が電極に引き込まれ、ギガシールの形成または電極と原形質膜との間の非常に緊密な接触が促進されます(図1B)。
14. ギガシールが形成されたら、市販のアンプで高速ダイヤルと低速ダイヤルを調整してピペットの静電容量を補正し、メンブレンテスト機能を使用してギガシールの安定性(リーク電流)を監視します。
15. アムホテリシン-Bがピペットに拡散し、主に一価陽イオンに選択的な細孔を形成する原形質膜に挿入されるまで、通常は30〜60分かかります。このステップでは、メンブレンテスト機能を使用してギガシールの監視を続けます。細胞の穿孔が増加すると、Membrane Test機能で測定された静電容量過渡現象の振幅も増加します(図1Bと図1Cで細胞の穿孔がない場合と有効な場合をそれぞれ比較してください)。
16. パッチの穿孔が最適な場合(通常は50MΩ未満の安定した直列抵抗で判断)、アンプのセル容量と直列抵抗のダイヤルを調整して、静電容量の過渡現象を相殺します。このとき、直列抵抗補償も実行できます(図1D)。
17. 指定されたプロトコルによって誘発される安定した電圧ステップ誘起陽イオン電流が観察されたら、化合物または生理学的条件を超融合による試験に適用し、市販の収集ソフトウェアで制御、試験条件、およびウォッシュアウト(可能な場合)の応答を記録します。
    1. DSMセルを-64または-74 mVに保持し、電圧を-94から+96または+106 mVまで400または500 msずつ10 mV刻みでステップアップし、保持電位に戻すルーチンの電圧ステッププロトコルで電流を記録します。
       手記：膜電位の値は、14 mVの液体接合電位に対して調整されます(PおよびE溶液を使用、表1)。液体のジャンクションポテンシャルは、商用の収集ソフトウェア(Table of Materials)でTools>Junction Potentialsをクリックし、溶液イオン成分の濃度を入力することで取得できます。ランププロトコルを使用して、現在の録音を取得することもできます。
    2. 実験中に電圧プロトコルを連続~1分間隔で実行し、追加前の制御、テスト条件、およびウォッシュアウトの電流を記録し
    ます

ソリューションの種類	組成(mM)
DS(解剖/消化液)	80 Na-グルタミン酸、55 NaCl、6 KCl、10 HEPES、2 MgCl2、11 グルコース、pH 7.4 に調整 (10 M NaOH)
DS-P(パパイン含有DS)	1〜2 mg/mL のパパイン、1 mg/mL のジチオスレイトール、1 mg/mL のウシ血清アルブミンを含む DS
DS-C(コラゲナーゼ含有DS)	1–2 mg/ml コラゲナーゼ II 型、1 mg/ml ウシ血清アルブミン、0 または 1 mg/ml トリプシン阻害剤、100-200 μM Ca2+ を含む DS 溶液
P(ピペット)	110 CsOH、110 アスパラギン酸、10 NaCl、1 MgCl2、10 HEPES、0.05 EGTA、および 30 CsCl、pH を 7.2 に調整し、CsOH で 7.2 に調整し、アンホテリシン B (300-500 μg/ml) を添加
E(細胞外)	10 塩化テトラエチルアンモニウム (TEA)、6 CsCl、124 NaCl、1 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES、および 10 グルコース、pH を 7.3–7.4 に調整し、NaOH または CsOH、および 0.002–3 (2–3 mM) ニフェジピン

表1:穿孔パッチクランプ実験で使用した解剖/消化液(DS)、ピペット溶液、細胞外溶液の組成。

Results

図1:ヒトDSM細胞のギガシール形成とアンホテリシンB穿孔に関与するステップの概略図。図は、アンホテリシンB含有ピペットとDSM細胞の空間位置と、商用取得ソフトウェア(Table of Materials)で電圧ステップ(この例では-10または-20 mV)を変更して抵抗を決定することによって得られた膜試験の関連応答を示しています。構成は、(A)電極による細胞アプローチ前、(B)アムホテリシン-B含有ピペット(赤い点で表されるアムホテリシン-B)を細胞表面に配置し、負圧を加えることによって得られるギガシール形成後、(C)ギガシール形成~45分後に示す細胞上の構成で、この時点でアムホテリシン-Bがピペットに拡散し、その分子が原形質...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5mlポリスチレン丸底チューブ	隼	352054	消化ステップで使用される酵素を含むDS用チューブ
アムホテリシン-B	漁夫	BP928-250	パッチ/細胞穿孔に使用
アムホテリシン-B	欧州薬局方参照標準	5	パッチ/細胞穿孔に使用
アムホテリシン-B	シグマ・アルドリッチ	A9528-100MG	パッチ/細胞穿孔に使用
アナログボルテックスミキサー	VWRの	58816から121
アスパラギン酸	シグマ・アルドリッチ	A9006	細胞内ピペット溶液
ウシ血清アルブミン	シグマ・アルドリッチ	A7906	ダッシー
CaCl2	シグマ・アルドリッチ	C1016	細胞外溶液とDS
キャピラリーガラス	サッター	BF150-110-7.5	引っ張られたパッチ電極の調製のためのキャピラリー
水酸化セシウム水和物	シグマ・アルドリッチ	C8518	細胞内ピペット溶液
Clampex ver.10ソフトウェアには、データ取得(Clampex)プログラムと解析プログラム(Clampfit)が含まれています	軸索機器/分子デバイス	pクランプ-10	商用ソフトウェアとパッチクランプリグセットアップの一部
セシCl	シグマ・アルドリッチ	203025	細胞外および細胞内ソリューション
デンタルワックス	ミルテックスデンタルワックステクノロジーズ株式会社	18058351
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・アルドリッチ	D2650	溶媒
エグタ	シグマ・アルドリッチ	E3889	Ca2+キレート剤、細胞内ピペット溶液に使用
フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー	サッター	P-97	非常に細い先端で電極を引っ張るために必要です
フローティングフォームチューブラック/ホルダー	VWRサイエンティフィック	82017-634	温度制御のための酵素入りチューブの保持に使用
グルコース	シグマ	G8270
グルタミン酸(Na塩)	シグマ・アルドリッチ	G1626	ダッシー
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H3375-J	pHバッファー
KClの	フィッシャーサイエンティフィック	BP366-1	細胞外溶液
低ノイズデータ収集システム	軸索機器/分子デバイス	デジデータ 1440A	パッチクランプリグセットアップの一部
マグネチックシェーカー	VWRの	01-442-684
MgCl2(六水和物)	シグマ・アルドリッチ	M2670	細胞外および細胞内ソリューション
マイクロフォージ	成茂	MF-830	火磨き電極に使用
NaCl	シグマ・アルドリッチ	S7653	細胞外および細胞内ソリューション
NaOH	シグマ・アルドリッチ	S8045
ニフェジピン	シグマ・アルドリッチ	N7634	L型電位依存性Ca2+チャネルブロッカ
ニコン倒立顕微鏡、TS100、T1-SMステージ、対物レンズ5倍、10倍、20倍、40倍	ニコン	中止	パッチクランプリグセットアップの一部
非金属シリンジ針、MicroFil	WPIの	MF-34G-5	細胞内ピペット溶液の充填
パスツールピペット	フィッシャーブランド	13-678-20A	チップを折ってファイヤーポリッシュし、酵素処理された組織の滴定に使用され、断片から単一のDSM細胞を放出します
パッチクランプアンプ	軸索機器/分子デバイス	アクソン アクソパッチ 200B	パッチクランプリグセットアップの一部
PCコンピュータ	谷間	カスタム構成	パッチクランプリグセットアップの一部
pHメーター	アスペラインスツルメンツ	PH700
ポリエチレンチューブ	イントラメディック	427-436	ガラス底記録室に接続された細胞外浴の超灌信用チューブ
塩化テトラエチルアンモニウム	シグマ・アルドリッチ	T2265	KvおよびBKチャネルのイオンチャネルブロッカーを細胞外浴液に添加
重み付けスケール	メトラー・トレド	XS64
ZeissAxiovert 40C 倒立顕微鏡 (10x および 40x 対物レンズ付き	カールツァイス	中止	パッチクランプリグセットアップの一部