糸球体単離:マウス腎臓から無傷の糸球体を得る技術

要約

出典:Eymael, J. et al.頭頂上皮細胞の活性化に関与する経路を解析するためのex vivoアッセイとしての糸球体伸長。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、マウスの腎臓から無傷の糸球体を分離する方法について説明しています。このようにして得られたカプセル化され、カプセル化解除された糸球体は、さらに、マウス腎臓から頭頂上皮細胞増殖を培養するために使用することができる。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>注:未治療の健康な野生型(WT)マウス(n = 4)およびcd44-/-(n = 4)マウスを12-16週齢で犠牲にしました。雄マウスと雌マウスの両方を使用しました。すべてのマウスはC57Bl/6の背景にありました。

>1. マウス腎臓解剖

1. 健康なWTマウスまたは遺伝子改変マウスを子宮頸部脱臼により犠牲にします。
マウスを犠牲にした
2. 直後にマウスの腎臓全体を解剖します。このためには、腹部ハサミを使用して開腹中央を行い、皮膚を切断し、次に腹部の筋肉を切断します。腸を取り出し、マウスの隣に置きます。
3. 腎臓を結合組織から解放し、外科用鉗子を使用して腎臓を引き出し、はさみで腎動脈、腎静脈、尿管を切断します。
4. 外科用鉗子で腎臓を保持して腎臓から腎カプセルを取り出し、別の鉗子を使用してカプセルを引き抜きます。
5. ウェルあたり2 mLのハンクス平衡塩溶液(HBSS)で調製した6ウェル細胞培養プレート(2腎臓/ウェル)に腎臓を置き、氷上に置きます。

2. マウス腎臓からの糸球体の分離

1. 腎臓を100mmのシャーレに移し、2つのメスを使用して腎臓を1〜2mmの小片にミンチします。みじん切りにした腎臓片を1〜2mLのHBSSを使用して濡らしておきます。.
2. みじん切りにした腎臓片を300μmの金属ふるいの上に置き、20mLシリンジのプランジャーを使用して腎臓をふるいにかけます。HBSSを挟んでふるいを繰り返しすすぎ、血清学的ピペットを使用してきれいなペトリ皿にフロースルーを収集します。ふるいの底側に残っている/付着しているものはすべてメスでこすり落として収集し、収集したフロースルー(腎臓ホモジネート)に移します。
3. HBSSで75μmのふるいを通して腎臓ホモジネートをすすぎます。フロースルーを収集し、続いてこのフロースルーを53μmのふるいですすぎます。HBSSを使用して両方のふるいを洗浄し、すべての小さな構造物を取り除きます
   手記：このステップでは、フロースルーはすすぐだけで、75 μmと53 μmのふるいには押し込まれません。HBSSによる洗浄は、ふるい上の破片や小さな構造物を取り除くために必要です。そのため、通常は合計で200〜300mLのHBSSを使用します。
4. 75 μmおよび53 μmのふるいに残っている腎臓の構造/材料を、ふるいの上面をダルベッコの改変イーグルス培地(DMEM)で洗浄し、20%の子牛胎児血清(FCS)を添加して、材料を6ウェル超低アタッチメントマイクロプレートに移します。
   手記：ふるいの上面を洗うには、ふるいを傾けた位置(>45°)で洗い流し、ふるいの端に腎臓材料を集めます。収集された材料は、カプセル化された糸球体とカプセル化解除された糸球体に濃縮され、いくつかの管状の断片のみを示します。カプセル化された糸球体は非常に粘着性があります。したがって、単一の糸球体を採取するには、糸球体がペトリ皿またはウェルプレートの表面に付着するのを防ぐことが重要です。付着を避けるために、20%FCSの媒体を使用し、このステップには超低アタッチメントプレートを使用してください。

3. 糸球体成長の培養

1. 超低添付マイクロプレートを倒立型顕微鏡に持って行き、20 μLピペットで1つのカプセル化および/またはカプセル化解除された糸球体を回収します。他の構造物や破片をピペッティングしないでください。ピペットチップに糸球体を1つ採取した後、腎臓材料を採取していない新鮮なDMEM培地を同じピペットチップに20μLの容量まで加えます。
2. 20 μL DMEM培地で1つの糸球体を24ウェル細胞培養プレートのウェルの中心に移し、37 °Cおよび5%(v/v)CO₂で3時間インキュベートして、糸球体をウェルの中心に付着させます。糸球体が井戸の境界に浮かぶのを避けるために、プレートを慎重に動かします。
3. 3時間のインキュベーション後、糸球体はウェルの中心に付着します。ヒドロコルチゾン、ヒト内皮成長因子、ウシ脳抽出物、ゲンタマイシン硫酸アンホテリシンBを含む成長因子キットを補充した500 μLの内皮基礎培地(EBM)を慎重に添加し(材料表)、さらに5%(v/v)FBSおよび1%(v/v)ペニシリン/ストレプトマイシン(ペン/連鎖球菌)を各ウェルに加えます。
4. 単一の糸球体を37°C、5%(v / v)CO₂.
   で6日間培養します 注:6日以内に、頭頂上皮細胞からなる成長物が形成されます。特定の化合物または薬物が頭頂上皮細胞に及ぼす影響をテストすることを目指す場合は、この6日以内に培地に追加する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
24ウェル細胞培養プレート	コーニング共演
デジタル倒立型光学顕微鏡	Westburg, EVOS FL顕微鏡
ダルベッコのモディファイドイーグルの媒体	ロンザ
ウシ胎児血清	ロンザ
ハンクスのバランスの取れた塩溶液	ギブコ
ペトリ皿	ザルシュテット		サイズ 100
メス	ダールハウゼン		サイズ 10
ふるい	エンデコッツ株式会社		サイズ:300μm、75μm、53μm、スチール
超低付着マイクロプレート	コーニング共演		6ウェルプレート
注射器	BDプラスティパック		サイズ:20mL