マウスモデルにおける同所性膀胱腫瘍のモデリング:マウス膀胱への癌細胞の膀胱内投与の手順

要約

出典:Tham, S. M. et al. A Mouse Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System.J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、マウスモデルの膀胱にがん細胞を送達する膀胱内手順について説明します。この手順は、治療戦略の開発に使用できる同所性膀胱腫瘍モデルを生成するのに役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 腫瘍の移植

>注:各マウスには、膀胱内の50μLのDMEMブランクメディアに1 x 10 5MB49-PSA細胞が埋め込まれています。カテーテルのデッドスペースのため、常に余分な容量を準備してください(マウスあたり少なくとも100μL余分)。別のアプローチは、空気で満たされた注射器を使用することです。

1. 細胞
   1. 移植の1日前、細胞が約80%コンフルエントになったら、MB49-PSA腫瘍細胞を完全なDMEM培地(10%FBS、2 mmol / L L-グルタミン、0.05 mg / mLペニシリン-ストレプトマイシン、および200 μg / mLハイグロマイシンBを補充)で37°Cおよび5%CO₂の分割比で1:2で継代します。
   2. 施術当日は、滅菌細胞スクレーパーで細胞を優しく掻き取って採取します。等量の細胞懸濁液と0.4%トリパンブルー溶液を混合します。血球計算盤を使用して生細胞をカウントします。細胞の20%以上が死んでいる場合は、移植しないでください。
   3. 必要な生細胞の数(2 x 10⁶細胞/mL)を計算し、15 mLの遠心チューブに移します。250 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞ペレットをDMEMブランク培地に再懸濁します。移植前に洗浄を3回繰り返して、FBSの痕跡をすべて取り除きます。
   4. マウスが移植する準備ができるまで、細胞懸濁液を氷上に置いておきます。
2. 4〜6週齢の雌C57BL / 6Jマウスを手順の1週間前に順応させます。.すべての動物作業は、無菌状態を維持するために生物学的安全キャビネットで行わなければなりません。
   1. 各マウスの体重を量り、体重10 gあたり0.1 mLで腹腔内に麻酔(75 mg / kgケタミンと1 mg / kgメデトミジン)を注射します。.体重は17〜22gである必要があります。つま先をつまんでも反応がないことを確認して麻酔を確認します。
   2. 識別のために、イヤーパンチを使用して耳に印を付けます。
   3. ハルトマン溶液または複合乳酸ナトリウムを、水分補給のために1〜2時間ごとに体重10 gあたり0.1 mLで腹腔内に注入します。.
   4. 麻酔下でまばたき反射が失われ、目が乾燥するため、滅菌綿球根を使用して滅菌眼軟膏を両眼に塗布します。必要に応じて再適用してください。
   5. マウスを仰臥位にして、ヒートパック(空気との接触によって活性化される)の上にペーパータオルの上に置きます。体温を維持し、後肢をテープで固定します。
3. 指で下腹部に穏やかな圧力をかけ、膀胱から尿を1.5mLの微量遠心チューブに集めます。このサンプルは、尿中PSAの基礎値として機能します。
4. 滅菌ポリ-L-リジン(PLL)を1mLシリンジに引き出し、ニードルスタイレットを取り外した状態で24ゲージIVカテーテルを取り付けます。カテーテルの先端に潤滑剤を塗布し、鉗子を使用して尿道から膀胱にカテーテルを挿入し、カテーテル挿入をガイドします。抵抗を感じたら停止
   注:研究者は、膀胱内点滴のための麻酔薬を含む潤滑ゲルの使用の必要性と、処置後の鎮痛薬の使用について獣医スタッフと話し合う必要があります。
5. 50 μL の PLL を 20 秒ごとに 10 μL の割合でゆっくりと注入し、血管逆流を回避します。カテーテルを膀胱に20分間放置し、ストッパーを付けて流出を防ぎます。
6. 20分後、カテーテルを取り外し、下腹部をそっと押して膀胱から内容物を空にします。空の1mLシリンジを使用して、カテーテルから残っている内容物を洗い流します。
7. MB49-PSA細胞をピペッティングで十分に混合し、1 mLシリンジに吸引します。カテーテルを取り付け、潤滑剤を塗布します。1 x 10⁵細胞50 μLを20秒ごとに10 μLの低速速度で注入します。カテーテルのストッパーを交換します。対照マウスに50μLの生理食塩水を与えます。
8. 1時間後、カテーテルを取り外し、内容物の膀胱を空にします。後ろ足のテープをはがし、マウスを腹側に置きます。体重10 gあたり0.1 mLで逆転薬(1 mg / kgアチパメゾール)を皮下注射することにより、マウスを蘇生させます。.
9. 運動性が観察されるまでマウスを監視します。マウスをケージに戻します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MB49-PSAセル			参考文献 (Wu QH, 2004)
ダルベッコのモディファイドイーグルの's ミディアム(DMEM)メディア	バイオウエスト	L0102
ウシ胎児血清(FBS)南アメリカ	バイオウエスト	S1810
ウシ胎児血清(FBS)南米、プレミアム	バイオウエスト	S181B型
ウシ胎児血清(FBS)	ハイクローン	03 SH30088
L-グルタミン Biowest X0550	バイオウエスト	X0550
ペニシリン-ストレプトマイシン	バイオウエスト	L0022
ハイグロマイシンB	インビトゲン	〒10687-010
C57BL/6J 雌マウス	インビボ		4-6週前
麻酔(75 mg / kgケタミンと1mg / kgメデトミジン)	地元の薬局
逆転薬(1mg / kgアチパメゾール)	地元の薬局
耳パンチ	電子顕微鏡科学	72893から01
ハルトマンの解決策または複合乳酸ナトリウム	B ブラウン
眼科用軟膏 - Duratears滅菌眼潤滑剤軟膏	アルコン
ヒートパック - HotHandsハンドウォーマー	ヒートマックス株式会社
Introcan Certo IVカテーテル	B ブラウン	4251300	24 G x 3/4インチ
アクアゲル潤滑ゼリー	地元の薬局
ポリ-L-リジン溶液、0.01%	シグマ	P4707