マウス膀胱の尿路上皮へのDNAプラスミドの送達:マウス膀胱の尿路上皮細胞にDNAプラスミドを効率的に送達するためのエレクトロポレーションベースの手順により、遺伝子操作モデルを生成する

要約

出典:Chuan, Y. et al.エレクトロポレーションによるマウス膀胱尿路上皮へのプラスミドDNA送達の新規方法。 J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、尿道カテーテル法とエレクトロポレーション技術を組み合わせて、マウスの膀胱の尿路上皮にDNAプラスミドを送達する様子を実演しています。記載された手順により、マウス膀胱癌モデルの生成が可能になります。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. プラスミドとツールの準備

1. トランスフェクションする各膀胱について、少なくとも20 μLのDNAプラスミド(1 μg/μL)を調製します。
2. 1.5 mLの微量遠心チューブ中の20 μLのプラスミド溶液に1 μLのトリパンブルーを加えます。よく混ぜるピペット。
3. すべての手術器具をオートクレーブし、70%エタノールでワークスペースを滅菌します。手術器具や手袋に70%エタノールを頻繁にスプレーするか、次の手順を実行するときはガラスビーズ滅菌器を使用して無菌状態を維持してください。

>2. プラスミドの送達

1. 麻酔をかけたマウス腹部に70%エタノールを塗布し、メスを使用して1cmの垂直切開を行い、膀胱の上の腹部皮膚を開きます。
2. 少なくとも 20 μL のプラスミドとトリパン ブルー溶液をカテーテルの外側の端にピペットで挿入し、シリンジを取り付けます。
3. プラスミド溶液を膀胱に注入します。.膀胱が青色に変われば、注射は成功です。膀胱に気泡が入らないように、カテーテルに液体を残しておきます。
4. ピンセットを使用して外部尿道開口部をつかみ、カテーテルとシリンジを取り外します。紐を使用して、外部尿道開口部を締めます。紐で2つのループを作り、次に2つの結び目で結びます
   手記：尿道の引き締めは、プラスミド液の逆流を防ぐために重要です。
5. 次のパラメータでエレクトロポレーションジェネレーターをオンにします:33V、50 msの動作時間、および950 msのインターバル時間。
6. ピンセットで膀胱を持ち、2つの電極で膀胱をつまみます。フットペダルを押してエレクトロポレーションを行います.
   手記：電気パルスは、ペダルを踏むたびに短い間隔で5回発生するように設定されています。このプロセスでマウスがけいれんすることがあります。フットペダルを複数回押すと、送達効率を上げることができますが、電気パルスが多すぎると、尿路上皮の組織完全性が損傷する可能性があります。
   1. ピンセットと電極が接触すると火花が発生するため、避けてください。

>3. リカバリー

1. 腹部と皮膚の開口部を滅菌済みの外科用縫合糸とクリップで縫合します。傷口にヨウ素を塗ります。
2. 動物をイソフルランシステムから取り出します。ブプレノルフィン鎮痛剤(0.1 mg / kg)を皮下投与して、術後の痛みを軽減します。.
3. 動物を加熱パッドに置き、完全に回復した後、自宅のケージに戻します。切開部が治癒するまで、動物に正常な可動性、飲酒、摂食行動、感染の兆候がないこと、および少なくとも1日1回動物をチェックし、その後クリップを取り外します。動物がグルーミングの減少、攻撃性の増加、発声などの痛みの症状を示している場合は、ブプレノルフィン鎮痛薬のその後の注射を投与します。.

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BD 1mL TB シリンジ	漁夫	148232E
ブプレノルフィン	シグマ	B9275-50MG
デュモンピンセット	ロボズ外科インストレーター	RS-5005	手術前に70%エタノールで治療してください
ECM830 SQウェーブエレクトロポレーター	ハーバード大学装置	450052
Exel International ディスポーザブル Safelet I.V. カテーテル	フィッシャーサイエンティフィック	14-841-21	24G、長さ2.11cm、外径0.045cm
極細マイクロ解剖ハサミ	ロボズ外科インストレーター	RS-5135	手術前に70%エタノールで治療してください
イソフルラン	獣医	501017
K&H 小動物用ヒーテッド レスト マット、9 x 12 インチ	アマゾン		ヒートマットをペーパータオルで覆います
眼科用軟膏	漁夫	NC0849514
PBS、pH 7.4	ライフテクノロジー	10010049
ピペットチップ 200 μL	USAサイエンティフィック	〒1111-0206
ピペットチップ、ユニバーサルフィット、0.1 〜 10 μL	漁夫	02707438(CS)
ピペットマン NEO P2	ギルソン	F144561
ピペットマン NEO P200N	ギルソン	F144565
プラスミド CAG-GFP	アドジーン	16664
プラチナピンセット5 mm	ハーバード大学装置	450489	直径5mm
鋏	ロボズ外科インストレーター	RS-5880	手術前に70%エタノールで治療してください
紐紐	アマゾン		曼荼羅工芸品150D 210D 0.8mm 1mmレザー縫製ステッチフラットワックス糸紐コード
テープ、スコッチ	漁夫	19047257
Therio-gel獣医用潤滑剤	PBSアニマルヘルス	353-736
トリパンブルーステイン	ライフテクノロジー	15250061
V-1 テーブルトップシステム麻酔	ベトエキップ	901806
Vicryl violet 縫合糸 18" FS-2 カッティング 5-0	漁夫	NC0578475
ウォルグリーンポビドンヨウ素10%	ウォルグリーン	953982
巻き取りクリップ	漁夫	18045
巻線クリップアプライヤー	漁夫	1804

の 年