エキソソーム単離:スクロースクッションを使用して培養細胞のコンディショニング培地からエキソソームを分離する密度ベースの超遠心分離技術

要約

出典:Faruqu, F. N. et al. がん細胞へのsiRNA送達のためのエクソソームの調製。J. Vis. Exp. (2018年度)

このビデオでは、酸化重水素で調製した25%(w/w)ショ糖クッションを使用して、ヒト胚性腎臓細胞培養物から採取したコンディショニング培地からエキソソームを分離するための密度ベースの超遠心分離技術について説明しています。単離されたエキソソームは、ダウンストリームアプリケーションに使用できます。

プロトコル

1. ショ糖クッションへのエキソソーム分離

1. 回収したコンディショニング培地(CM)を、以下のように遠心分離と濾過により事前に透明化します。
   1. 500 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄します。この遠心分離ステップをもう一度繰り返し、上清を回収してペレットを廃棄します。
   2. ステップ1.1の上清を2,000 x gで15分間4°C遠心分離し、ペレットを廃棄します。回収した上清を0.22μmフィルターで一度ろ過します。
2. プレクリアリング中に、ユニバーサルチューブ内の1.9 g(± 0.001 g)のスクロースを正確に秤量し、重量が7.6 g(± 0.001 g)に達するまで酸化重水素を補充することにより、酸化重水素中の25%(w / w)ショ糖溶液を調製します。
3. 超遠心チューブ(材料表を参照)に22.5 mLのプレクリア済みCMを充填し、現在の容量がそれより少ない場合は、0.22 μmフィルターPBSでCMを22.5 mLにします。
4. ガラスピペット(材料の表を参照)をチューブに入れ、それを通して3 mLのショ糖溶液を加えて、溶液がCMの下に別の層を形成するようにします。
5. 層状のCM /スクロース溶液を含むチューブをスイングアウトローターのバケツに慎重に置き(材料の表を参照)、バケツをローターに固定します。
6. ローターを超遠心分離機(材料表を参照)に入れ、100,000 x gで4°Cで1.5時間回転します。
7. 2 mLのスクロース層を採取し、これを20 mLのろ過済みPBSが入った超遠心分離ボトル(材料表を参照)に加えて洗浄ステップを行います。
8. チューブを固定角ローター(材料表を参照)に入れ、100,000 x gで4°Cで1.5時間回転させます。
9. 10 mLの血清学的ピペットで上清を慎重に取り除き、400 μLのろ過済みPBSでペレットを再懸濁します。このエキソソームストックは、短期保存用および長期保存用にそれぞれ4°Cまたは-80°Cに保ちます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
蔗糖	フィッシャーサイエンティフィック	S/8600/60	1キロ
酸化重水素(D2O)	シグマ・アルドリッチ	151882	250グラム
1X リン酸緩衝生理食塩水	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010015	500ミリリットル
Millex-GP シリンジフィルターユニット 0.22 μm	ミリポア	SLGP033RS
超遠心分離機	ベックマン・コールター	オプティマ XPN-80
スイングアウトローター	ベックマン・コールター	SW45 チタン
固定角ローター	ベックマン・コールター	タイプ70 Ti
超遠心チューブ	ベックマン・コールター	355631	ポリカーボネート 最大充填量 32 ml
超遠心ボトル	ベックマン・コールター	355618	ポリカーボネート 最小充填量 16 ml、最大充填量 25 ml
遠心機	エッペンドルフ	5810R型
ガラスピペット	フィッシャーサイエンティフィック	〒1156-6963
25% w/wショ糖クッション			ユニバーサルチューブに1.9 g(± 0.001 g)のスクロースを加え、重量が7.6 g(± 0.001 g)に達するまでD2Oを補充します。これにより、25% w/w ショ糖クッションが ~6ml になります。