エレクトロポレーションを用いたエキソソームへのsiRNAカプセル化:エキソソームにsiRNAをロードするための電気パルスベースの技術

要約

出典:Faruqu, F. N. et al.がん細胞へのsiRNA送達のためのエクソソームの調製。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、siRNAをエクソソームにカプセル化するためのエレクトロポレーションベースの方法を説明しています。siRNAをロードしたエクソソームは、その後、治療用途に使用できます。

プロトコル

1. エレクトロポレーションによるエキソソームへのsiRNAカプセル化

1. エレクトロポレーションキュベット(材料の表を参照)を氷上で30分間予冷してから、エレクトロポレーションします。
2. 7.0 μgのエキソソーム(PBS中の7 x^{10 12} p/mLストックから32 μL)と0.33 μgのsiRNA(RNaseフリー水中の2 μMストックから12 μL)をマイクロ遠心チューブで混合します。クエン酸バッファーで容量を150 μLにします(材料の表を参照)。この場合、エキソソームとsiRNAのモル比は1:60です。
3. 混合物をエレクトロポレーションキュベットに移します。キュベットにキャップをして、エレクトロポレーターのキュベットホルダーに入れます(材料の表を参照)。回転ホイールを時計回りに180°回転させます.
   手記：キュベットが電極に接触するためには、ホイールを完全にロック位置に回す必要があります。
4. 目的のエレクトロポレーションプログラム(X-01、X-05、A-20、T-20、T-30など)を選択し、スタートボタンを押してエレクトロポレーションを開始します
   手記： 正常なパルスは、ディスプレイに「OK」と表示されることで示されます。
5. エレクトロポレーションが完了したら、ホイールを反時計回りに180°戻した後、キュベットを取り外します。プラスチックピペットでキュベットからサンプルを引き出し、さらに処理します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Atto655-siRNA	ユーロジェンテック	SQ-SIRNAの	(ラベル付き-S)UGC-GCU-ACGAUC-GAC-GAU-G55;(ラベルなしAS)CAU-CGU-CGA-UCG-UAGCGC-A55。
ガラスピペット	フィッシャーサイエンティフィック	〒1156-6963
アマクサヌクレオフェクターI	ロンザ	ヌクレオフェクターI	AmaxaのNucleofectorキットを使用
EDTAを含むクエン酸バッファー			0.1954 gのクエン酸と0.2087 gのリン酸二ナトリウムを50 mLの脱イオン水に混合します。.EDTAを0.1 mMに添加します。pHを4.4に調整します。
マイクロチューブ	スターラブ	S1615-5500	1.5ミリリットル