マウス腎細胞単離:腎尿細管上皮細胞の初代培養を単離および作製する技術

要約

出典:Ding, W. et al. マウス初代腎尿細管上皮細胞の単離、特性評価、ハイスループット細胞外フラックス分析。 J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、幅広い分子生物学および細胞培養研究のために、腎尿細管上皮細胞を単離および精製する手順を示します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 組織プロセシングと初代尿細管細胞の単離

1. 腎嚢と髄質を取り出し、両方の腎臓を細かく刻み、37°Cのオーブンで10 mLの消化緩衝液に5分間穏やかに回転させてインキュベー
トします。
2. 未消化の腎臓組織を70 μmフィルターに通して、バッファーを除去します。10 mLの培地を加えて消化を停止します。
3. 管状細胞を回収するには、ろ過した細胞懸濁液を50 x gで5分間遠心分離し、最初のペレットを回収します。上清を新しいチューブに移し、5 mLの培養培地を加え、50 x gで5分間遠心分離して、すべての尿細管細胞が2番目のペレットに収集されるようにします。遠心分離は低速で行われ、主に重い尿細管をペレット化します。その後、細胞が単離から回復した後、純粋な管状培養物は、継代培養中に高速で遠心分離されます。
4. 最初のペレットを20 mLの培養培地に再懸濁し、50 x gで5分間遠心分離して、3番目のペレットを回収します。
5. 2番目と3番目のペレットを1 mLの培地に再懸濁します。10 μLの細胞懸濁液を10 μLのTrypan Blueと混合し、混合物を計数スライドのチャンバーAにロードし、自動セルカウンターから細胞生存率を記録します。
6. コラーゲンで事前にコーティングされた単一の60 mm皿に最大10個の⁷細胞(不均一な集団)を播種し、管状細胞を一晩付着させます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コラーゲンI.ラットプロテイン、テール	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1048301
コラゲナーゼII型	ワージントン	LS004176
腎上皮細胞増殖培地2キット	プロモセル	C-26130
TC10自動セルカウンター	バイオ・ラッド	506BR2119