過ヨウ素酸シッフまたはPAS染色:糸球体の構造変形を評価する方法

要約

出典:Stevens, M., Oltean, S. 糸球体疾患のマウスモデルにおける腎機能の評価。J. Vis. Exp. (2018年度)

このビデオでは、腎臓糸球体の構造異常を評価するために過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色を行うためのプロトコルについて説明します。PAS染色法により、糸球体の病態生理を適切に評価することができます。

プロトコル

1. 過ヨウ素酸シッフ (PAS) 染色

>注:PAS染色は、糸球体毛細血管ループの基底膜と管状上皮を強調します。これにより、糸球体細胞、メサンギウムマトリックスと電位拡張、およびGBMの潜在的な変化(すなわち、肥厚と不規則性)の詳細な視覚化が可能になります。

1. パラフィン包埋されたPFA固定腎皮質を、厚さ5 μmのミクロトームを使用して、ポリ-L-リジンコーティングスライド上に切片化します。37°Cで1時間乾燥させます。セクションに、顕微鏡下で形態を歪める可能性のある折り目や穴が含まれていないことを確認してください。
2. スライドを脱パラフィンするには、キシレン(CAUTION、刺激性、ヒュームキャビネットで使用)で各3分間、100%EtOHで各3分間2回、次に95%、70%、および50%EtOHで各3分間、すべて室温で2回インキュベートします。スライドをdH₂Oで再水和します。
3. スライドを過ヨウ素酸溶液(注意、刺激性、ヒュームキャビネットで使用)(1 g / dL)で5分間インキュベートし、次にdH₂Oを数回変更してスライドをすすぎます。
4. スライドをSchiff試薬(パラソアニリンHCl 6 g/Lおよびメタ重亜硫酸ナトリウム4%HCl 0.25 mol/L)で室温15分間インキュベートします。スライドを水道水で5分間洗います。
5. ヘマトキシリンで3秒間対比染色した後、流水でスライドを15分間完全にすすぎます
   手記：ヘマトキシリン染色の最適な時間を決定するには、いくつかの最適化が必要になる場合があります。
6. 脱水プロトコルの逆を使用してスライドを脱水します。キシレンで仕上げます。
7. エアドライスライドし、キシレンベースの封入剤でマウントします。
光学
8. 顕微鏡で400倍の倍率で画像化し、糸球体構造を評価します。GBMの肥厚と不規則性、毛細血管ループの崩壊、線維性組織、硬化症、細胞増殖(内皮細胞、足細胞、メサンギアル細胞、または房に浸潤する炎症細胞)を評価します
   手記：糸球体病態生理学を包括的に評価するには、尿細管など、腎臓の他の場所の病変を評価する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
過ヨウ素酸-シッフ(PAS)染色システム	シグマ・アルドリッチ	395B-1KT
ヘマトキシリン	シグマ・アルドリッチ	H3136-J
キシレン	メルクミリポア	108298
ポリプレップスライド	シグマ・アルドリッチ	P0425-72EA
封入媒体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	8030
疎水性ペン	アブカム	AB2601
蛍光灯ミスクロスコープ	ライカマイクロシステムズ
Image J解析ソフトウェア	画像J