流体力学的腎骨盤注射:マウスモデルの腎臓細胞にDNAを直接送達する技術

要約

出典:Woodard, L. E. et al.腎臓におけるタンパク質の非ウイルス発現のための流体力学腎盂注射。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、核酸トランスフェクションのためのマウス腎臓の腎盂へのプラスミドの流体力学的注入のプロトコルを紹介します。この技術は、高い静水圧の原理を利用してプラスミドを特定の部位に強力に駆動し、組織損傷を引き起こさずにプラスミドの臓器特異的な送達を可能にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 流体力学腎盂注射手術を行う

1. 手術用のマウスを慎重に選択してください.
   注:株固有の違いはまだ観察されていませんが、可能性があります。ほとんどの注入は、C57BL/6 または FVB バックグラウンドで行われています。腎盂注射は、生後6〜12週齢のマウスに最も効果的です。16週を超えるマウスでは、理由は不明ですが、ルシフェラーゼイメージングによる最大50%の失敗が可能です。.肝臓への流体力学的尾静脈注射でも同じ加齢に伴う失敗率が観察されているため、これは流体力学的注射の原理に関連する一般的な制限である可能性があります。同じ線に沿って、他のものは、線維性ラットの肝臓への流体力学的尾静脈注射が健康な肝臓ほど効果的ではないことを示しているため、腎線維症の設定では腎盂の流体力学的注射がそれほど効果的ではない可能性があることを示していますが、これは直接テストされていません。

2. 手術用のマウスとDNA注射器の準備

1. マウスにケタミンとキシラジンで麻酔をかけます。
   1. 使い捨ての実験用エプロン、外科用フェイスマスク、ニトリル手袋など、動物施設が必要とする適切な個人用保護具を着用してください。
   2. 一度に2〜4匹のマウスで作業し、0.1 gの精度のスケールで500 mLプラスチックビーカーで各マウスを計量します。通常の0.9%生理食塩水で希釈した24 mg/mLケタミンと2 mg/mLキシラジンの正しい量を計算して、腹腔内注射によって各マウスに投与します(腹腔内注射の詳細については、参照ビデオを参照してください)。式(50μL+((5μL)x(重量(g)))を使用するか、地元の獣医師チームとIACUCと相談した後、別の式に従って計算します。
   3. 標準的な技術による腹腔内注射によりマウスを注入します。マウスが動かなくなるまで、マウスを紙バケツに入れます。
      注:マウスは、つま先つま先つまみテストに反応しなくなったときに手術の準備ができています。最初の注射から20〜30分後につま先つまみテストに反応し続けるマウスに、反応の強さに応じて、麻酔薬を20〜60μL多く与えます。
   4. マウスを青いパッドで覆われた水循環式ヒートパッドに置き、角膜の乾燥を防ぐために両目に獣医軟膏を置きます。
2. マウスの背の左側を肩から臀部、脇腹から背骨まで、ペットのグルーミング用に設計されたシェーバーで剃ります。抜け毛や破片を取り除きます。
3. 麻酔をかけたマウスごとに、希釈したDNA100 μLを含むシリンジを別途調製し、気泡がないことを確認します。
   1. 滅菌済みの29G x 1/2インチ 0.5 mL U-100 インスリン注射器を使用し、針を恒久的に取り付けて安全性なしで使用します。
      注:シリンジタイプは非常に重要です。このゲージは、迅速な注入を可能にします。恒久的に取り付けられた針は、溶液が漏れるのを防ぎます。安全性の存在は、腎盂へのアクセスを妨げます。材料表に指定されているシリンジは、試験した他のブランドよりも注入時に均一に滑る。
   2. シリンジを~120μLにセットし、プランジャーを引き下げて上部にスペースを作ります。すべての気泡が上に上がるまでペンでタップします。針を上に持ち、プランジャーを慎重に押し下げて、針の先端に液滴が形成されるまですべての空気を取り除きます。目に見える泡は、動物を殺す空気塞栓症を引き起こす可能性があるため、存在してはなりません。
   3. シリンジに100μLが入るまでプランジャーを下げ、余分なDNA溶液を元のマイクロフュージチューブに空にします。必要に応じて慎重にラベルを付け、負荷のかかったシリンジを滅菌ドレープに置いて、作業が行われている施設で針の再調整が許可されていない場合は無菌性を維持します。

3. 注射手術を行う

1. 手術のためのサイトを準備します。滅菌ドレープをヒートパッドの上に置き、滅菌手術器具を空にして、それらに触れずに滅菌ドレープに置きます。マウスを手に取り、視野内に置きます。照明を調整してエリアを照らします。
2. 3つの3.15%グルコン酸クロルヘキシジンと70%イソプロピルアルコールの皮膚消毒スワブをパッケージから取り出し、動物の近くに置きます。.
3. 滅菌手術用手袋に交換します。切開部位から円を描くように作業し、新しいクロルヘキシジン/アルコール綿棒で動物を3回綿棒します。
4. 図1Aに示すように、切開部位を特定します。ピンセットで皮膚をつまみ、はさみを使用して、背骨から約1 cm、胸郭の下の皮膚層に切り込みを入れます。カット部位の長さが約1cmになったら、下の筋肉層に同様のカット部位を作ります.
   注:腎臓が切開部をかろうじて通過し、切開部自体によって所定の位置に保たれるように、切開部を適切な長さにします。切開が小さすぎると、腎臓が露出できません。大きすぎると、腎臓は絶えず腹腔内に戻ります。
5. 腎臓を見つけます.
   手記：それは白い脂肪組織の中に見えるかもしれません。脾臓も動物の左側にあります。これらの臓器の色は、脾臓が暗い栗色で、腎臓が濃い赤橙色であるため、視覚的に区別できます。脾臓は簡単に破裂する可能性があるため、脾臓を操作することは望ましくありません。
6. 腎臓に触れずに、指で腹部にしっかりと優しく圧力をかけ、腹腔からそっと露出させます(図2C)。必要に応じて、閉じたピンセットを使用して、望ましくない臓器を腹部にそっと押し戻します。開いた鉗子は、腎臓や他の臓器に損傷を与える可能性があるため、使用しないでください。
7. 腎臓が腹部から出たら、腎盂である小さな白い点を視覚化するのに十分なだけ、周囲の脂肪から腎臓をそっと分離します(図1B)。余分な脂肪を片側に押し込むか、必要に応じて取り除きます。腎臓の上部の極の近くにある副腎や腎臓嚢を取り外さないように注意してください。
8. 閉じた鉗子を使用して腎臓の右側を押し下げ、腎盂が見えるようにし、ロードされたインスリン注射器を右手でつかみ、針を腎盂に向けて作業面と平行に保持します(図2E)。図1Bに示すように、固定された腎臓の腎盂に針を慎重に挿入します。
9. 3秒以内に溶液を素早く注入します。腎臓の約3分の1が透明になり、色が白に変わります.
   注:注射後の腎臓嚢内の体液の蓄積と血腫の形成が観察されるのが一般的です。検出に十分なレベルのDNAトランスフェクションを達成するためには、ある程度の損傷が必要です。
10. 溶液の逆流を防ぐために、針を約10秒間所定の位置に保ちます。.次に、針を慎重にゆっくりと取り外します。切開部位をやさしく伸ばし、閉じた鉗子を使用して臓器を腹腔に戻します。
11. 動物の筋肉層を5〜0個の吸収性縫合糸で縫合し、2〜4個の独立した結び目を配置します。
12. 動物の皮膚層を5-0または6-0の非吸収性ナイロン縫合糸で縫合し、2〜4個の独立した結び目を配置します><。 注:手術器具は、滅菌ビーズバスに入れて冷却した後、再利用できます。

結果

図 1.流体力学的な腎盂注射のための正しい切開部位と針の配置。A)切開部(赤い線)は、マウスの背骨から約1cm、胸郭から約1cm下に配置する必要があります。B)腎臓が脇腹切開を介して露出した後、腎盂は腎臓の真ん中に小さな黄色がかった透明/白い点として配置する必要があります。注射は腎静脈、腎動脈、または尿管を乱してはなりません。.インスリン注射器の針は、図のように腎盂に直接挿入され、約0.5cmの深さまで挿入され、2〜3秒で急速に押し下げられます。

図 2.プラスミドDNAの腎盂流体力...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AnaSedキシラジン	パターソン獣医	07-808-1947	麻酔薬 - 非規制物質
BDインスリンシリンジ0.5mL29G1/2インチ	カーディナルヘルス	309306	必要なシリンジ
ブプレネックス	薬剤師/獣医師		鎮痛-規制物質。
極細マイクロ解剖ハサミ	Roboz手術器具	RS-5882	手術器具
ゲイマーヒートポンプ	パラゴンメディカル	TP-700	水循環式ヒートポンプ
ジャーミネーター500	Roboz手術器具	DS-401	手術中に手術器具を再利用するには
グレーフ鉗子	Roboz手術器具	RS-5136	手術器具
Graefe組織鉗子	Roboz手術器具	RS-5153	手術器具
Halseyニードルホルダー、長さ5インチ	Roboz手術器具	RS-7841	手術器具
ヒートパッド - 15インチ x 21インチ - 少なくとも 3 個必要	パラゴンメディカル	TP22Gの	Gaymarヒートポンプと併用
ケタミン	薬剤師/獣医師		麻酔薬 - 規制薬物
Prevanticsスワブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23-100-110	皮膚手術の準備に
Prolene 5-0縫合糸テーパー30インチ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NC0256891	皮膚用非吸収性縫合糸
Puralubeブランド眼科軟膏	パターソン獣医	07-888-2572	手術中に目を潤すために
Vicryl 5-0縫合糸J303H	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NC9816710	筋肉層用の吸収性縫合糸
ウォールミニアルコクリッパー	メッド-獣医インターナショナル	イ8787-1550	肌の準備のためのシェーバー

(代表)