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1. 細胞の移植
Renca細胞をレレン内に移植するには、Renca細胞をハンク平衡塩溶液(HBSS)で2 x 106細胞/ mLの単一細胞懸濁液に調製します。
- HBSS中の0.25%トリプシンを使用して、接着性Renca細胞を組織培養フラスコから除去します。~5分後、フラスコに完全なRPMIを加えてトリプシンを中和し、細胞を遠心チューブに移して洗浄します。細胞を300の相対遠心力(rcf x g)で25°Cで5分間遠心分離します。
- 上清をデカントし、細胞をHBSSに再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞をカウントし、HBSSで容量を調整して2 x 106細胞/mLを生成します。
- 18ゲージの針を取り付けた1mLのシリンジに細胞を引き込み、細胞へのせん断ストレスを防ぎます。腫瘍細胞を注入する前に、18ゲージの針を28ゲージの針と交換してください。0.1mLの注射で、2 x 105細胞が腎臓に送達されます。
2. 手術部位の準備
- バイオセーフティキャビネットに滅菌手術用エリアを準備します。これには、滅菌済みの手術用ドレープを加熱パッドの上に置きます。鉗子、メス、はさみ、点眼薬、5%ポビドンヨード消毒剤、滅菌ガーゼなど、すべての物資を集めてください。使用前にすべての器具をオートクレーブにかけてください。
- 無菌先端技術を使用して手術を行います。ビード滅菌器で動物間の器具を再滅菌します。滅菌手袋、白衣、フェイスマスクを着用してください。
3. 動物の調理法
- 施設のガイドラインに従って、ケタミン/キシラジン (それぞれ 87.5 mg/kg と 12.5 mg/kg、i.p.) でマウスを麻酔します。つま先をつまむことにより、麻酔の深さを決定します。
- 動物が反応しないと考えられる場合は、Balb / cマウスの注射部位(左脇腹など)を、毛皮を(指で)摘むか(バリカンを使用して)剃ります。.
- マウスを手術準備エリア(ハウジングケージなど)から手術エリアに移動し、乾燥を防ぐために目に獣医軟膏を塗布します。準備した切開部位を5%ポビドンヨード消毒剤でたっぷりと綿棒で拭きます。
- 術前鎮痛薬として、切開を行う領域に塩酸ブピバカイン(2.5 mg / mL溶液、皮下0.1 mL)を注入します。
- 動物の左脇腹に1回(~1.0〜1.5cm)切開を行い、腹膜を貫通しないように慎重に滅菌メスまたはハサミを使用します。真皮を腹膜から滅菌ハサミで分離します。切開部位を滅菌綿ガーゼで軽くたたいて、血液を取り除きます。
- マウスを両手で持ち、左手で頭を持ち、右手で脇腹を支えます。
- 腹膜を通して脾臓を特定し、右手の1本の指でマウスを下から触診します。これで、腹膜を通して腎臓が見えるようになります。動物をしっかりと保持して、腹膜と腎臓全体に緊張を与えます。
- 2人目の人に、28ゲージの針が取り付けられた1mLの注射器を使用して、腫瘍細胞(セクション1.2で準備)を無傷の腹膜から腎臓の中心に注入してもらいます。0.1 mL(2 x 105)の細胞をゆっくりと送液します。細胞が注入されたら、針を所定の位置に5〜10秒間保持して、細胞の逆流を減らします。このステップでは、細胞を注入する人がマウスを持っている人の指に針を近づけるため、細心の注意が必要であることに注意することが重要です。
- 針を取り外し、シアノアクリレート組織接着剤の薄層で切開部を閉じます。
- 滅菌ペーパータオルで動物を清潔なケージに戻します。動物が加熱パッドで回復するのを待ちます。回復期間中は動物を放置しないでください。動物が直立して胸骨になるまで、動物を標準的な住居の状態に戻さないでください。実験動物を使用するすべての手続きにおいて、施設のガイドラインに従ってください。