逆相タンパク質アレイに基づくタンパク質発現解析:細胞溶解物からの複数のタンパク質の発現の同時定量化のための手順

要約

出典: O'Mahony, F. C. et al. The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers. J. Vis. Exp. (2013年)

このビデオでは、細胞ライセートからのタンパク質発現パターンを研究するために、逆相タンパク質アレイ(RPPA)を実行する方法を紹介しています。RPPAでは、タンパク質の混合物を含むライセートをニトロセルローススライドに印刷し、蛍光標識抗体を使用して目的のタンパク質を分析します。

プロトコル

1. RPPA印刷

1. タンパク質ライセートは、MicroGrid IIロボットスポッターを使用して、ニトロセルロースでコーティングされたスライドガラス(Fastslides-Whatman)にスポットされました。使用したスライドには、サンプルがスポットされた2つのパッドが含まれていました。各パッドには同一のサンプル(この場合は100個のサンプル)が見つかりました。その他の使用可能な形式には、1、8、および 16 パッド スライドがあります。パッドの数が多いほど、各パッドにスポットできるサンプルの数は少なくなります。
2. 各サンプルから一連の 5 回の 2 倍希釈を行い、それぞれを 3 回に分けてスポットしました(サンプルあたり合計 15 個のスポットが得られました)。

2. RPPAタンパク質検出

1. 余剰のLiCor Blocking Buffer(PBSで50:50に希釈)でスライドを湿らせます。RTでロッキングプラットフォーム上で1時間インキュベートします。
2. LiCor Blocking Buffer (PBSで50:50に希釈) に800 μLの一次抗体を所望の濃度で調製し、氷上に保持します。
3. スライドを(i)シングルフレームチップクリップまたは(ii)「FastFrame」4ベイスライドホルダーのいずれかに取り付けて、スライドとインキュベーションチャンバーの間にしっかりとシールが形成されるようにします。
4. ウェルから残留バッファーを取り出し、600 μLの一次抗体を各ウェルに添加します。
5. スライドとチャンバーを密閉されたウェットボックスに入れ、ロッキングプラットフォーム上で4°Cで一晩インキュベートします。
6. 0.1% PBS-Tween20 (PBS-T; 100 μL Tween 20/100 mL PBS) を調製します。
7. 冷蔵室からスライドを取り出し、各ウェルから一次抗体を慎重に取り出します。
8. 600 μLのPBS-Tを添加し、スライドをロッキングプラットフォーム上でRTで5分間(X3)洗浄します。
9. 蛍光標識二次抗体を調製するには、まずOdyssey Blocking Buffer(PBSで50:50に希釈)0.01%SDS、1:2,000希釈(1 μL/2 mL)で希釈します。
10. ウェルからバッファーを取り出し、600 μLの蛍光標識二次抗体を各ウェルに加えます。二次抗体を室温で45分間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。メンブレンが最終的にスキャンされるまで、メンブレンを光から保護することが重要です。
11. ウェルから二次抗体を取り出し、600 μL PBS-Tで室温で短時間洗浄(x3)します。キャリアからスライドを取り出し、適切な容器に移し、メンブレンを暗所に保ちながら、余分なPBS-Tを15分間洗います。
12. PBS-Tを取り外し、さらにメンブレンをPBSで室温で15分間洗浄して残留Tween-20を除去し、メンブレンを再び暗所に保ちます。
13. Fastslideを50°Cオーブンで10分間乾燥させた後、Li-Cor Odysseyスキャナーでスキャンします。スライドをスキャンするまで、スライドを暗闇に置いておきます。
14. スライドを680 nmおよび/または800 nmでスキャンします。これは、使用する二次抗体によって異なります。2色検出では、交差反応性を最小限に抑えるために、常に交差吸着性の高い二次抗体を使用してください。2色検出には、一次抗体と二次抗体を慎重に選択する必要があります。最も重要なのは、2つの主要な抗体について異なる宿主種(ウサギとマウスなど)を選択することです。これにより、容易に識別可能な発光スペクトルを持つ色素で標識された抗ウサギおよび抗マウス二次抗体による識別が可能になります。
15. イメージ ファイルは .tiff ファイルとして保存されます。図 1 は、スキャンされたファイルのイメージを示しています。

結果

図1.RPPAスキャンプロセスのフロー図

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリトンX-100	トリトン-X	T8787
Li-Cor Odyssey ブロッキングバッファー	リコー	〒927-40000
MicroGrid II ロボット スポッター	バイオロボティクス
FastFrameの4ベイスライドホルダー	ワットマン	10486001
FASTスライド - 2パッド	ワットマン	10485317
IRDye 680LT ヤギ抗マウス IgG	リコー	〒926-68020
IRDye 800CW ヤギ抗ウサギIgG	リコー	〒926-32211