ゼブラフィッシュ胚へのネフロトキシンの静脈内マイクロインジェクション:ゼブラフィッシュ胚の血流にネフロ毒性物質を送達する技術

要約

出典:McKee, Robert A. et al.急性腎障害をモデル化するためのゼブラフィッシュのネフロトキシンマイクロインジェクション。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオは、腎機能に対する化学的影響を研究するために、ゼブラフィッシュの胚の尾静脈にネフロトキシンを静脈内注射する方法を示しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 溶液の準備

1. 5 Lの蒸留水に73.0 gのNaCl、3.15 gのKCl、9.15 gのCaCl₂、および9.95 gのMgSO₄を混合して、E3胚培地の50倍ストック溶液を作製し、室温で保存します。
2. 5 Lの蒸留水に73.0 gのNaCl、3.15 gのKCl、9.15 gのCaCl₂、および9.95 gのMgSO₄を混合して、E3胚培地の50倍ストック溶液を作製し、室温で保存します。
3. ゼブラフィッシュ胚の培養には、E3胚培地ストックの50倍ストック溶液を蒸留水を含む1xワーキング溶液に希釈し、1x E3の1 Lごとに0.05%メチレンブルーの200 μLを加えて殺菌剤として作用させ、RTで保存します。
4. 50x E3ストック40 mLと0.06 mg PTUを組み合わせて、0.003% 1-フェニル-2-チオ尿素(PTU)を含むE3胚培地の色素沈着遮断溶液を作製します。次に、蒸留水で容量を合計2Lにします。
5. RTでE3 / PTU O / Nを攪拌して、PTU粉末を溶液に入れます。次に、E3/PTUをRT.
   に保存します。 手記：E3/PTUの賞味期限は約1週間で、古い溶液ではゼブラフィッシュの幼生の色素沈着の進行を防ぐ効果が低くなります。
6. 蒸留水500mLにトリカイン1gを加えて0.2%トリカイン(MS-222)の麻酔液を作製し、1Mトリス、pH9.5でpHを7.2に調整します。

2. 道具の準備

1. マイクロインジェクション用の胚の位置決めに使用される胚マニピュレーターツールを、5インチのストレート解剖針の端にゲルローディングチップを取り付け、テープまたは瞬間接着剤で固定して準備します。
2. ニードルプラーを使用してマイクロインジェクション針を準備し、最初にフィラメント付きのファイヤーポリッシュされた10cmホウケイ酸ガラスを器具に入れ、ハンドルを締めてホウケイ酸ガラスを固定します。
3. ホウケイ酸ガラスを引っ張って、細いテーパー針を作ります。次の設定を使用します: heat 540、pull 245、velocity 200、time 125。
4. ペトリ皿の中に針を置き、モデリング粘土のストリップに吊るして針先を保護し、ほこりの蓄積を防ぐために皿を覆ったままにします。
5. マイクロインジェクション用の針の準備を完了するには、かみそりの刃または細い鉗子のエッジを使用して針の引っ張られた端を切断し、直径約0.05〜0.1mmの鋭い角の注入チップを作成します。
6. マイクロインジェクショントレイを作成するには、100 mLの三角フラスコに1.5%アガロース/E3溶液を調製し、E3を電子レンジで沸騰するまで加熱してアガロースを溶解し、室温で約10分間冷却します。
7. 冷やしたアガロース/E3溶液をシャーレに注ぎ、深さ約0.5cmの土台を作ります。これが固まったら、深さ約0.3cmの2番目の層を注ぎ、プレハブの胚井型を挿入し、アガロースをRT.
   で固化させます 手記：上部の寒天/E3層に金型を挿入する場合は、気泡の数を減らすために、金型を寒天に斜めに配置してください。
8. マイクロインジェクショントレイ全体が固まったら、プレハブ胚ウェルをスクーピュラを使用してゆっくりと慎重に型を取り出し、皿にE3溶液を充填して4°Cで保存します。

3. ネフロトキシン溶液のマイクロインジェクション

1. 注射当日は、適切なビヒクル制御とともに、目的のネフロトキシン溶液を準備します。
2. 薬物が溶液中にあることを確認し、チューブの側面と水柱の上部を確認しながら、穏やかに渦巻くか混ぜます
   手記：ネフロトキシン溶液は、微量の蛍光標識デキストランを含むように調製して、マイクロインジェクションの効率を監視し、その後の時点での腎クリアランスも評価できます。
3. 細いゲルローディングチップを針の後ろに通して、トリミングしたマイクロインジェクション針に~2〜3μLのネフロトキシンをロードし、テープで針を垂直に吊り下げて、トリミングした針先に重力で溶液が満たされるようにします。
4. 針先がいっぱいになったら、ロードした針をマイクロマニピュレーターに固定します。
5. マイクロメータスライドに鉱油を一滴垂らしてマイクロインジェクション量をテストし、オイルに注入して液滴サイズを評価します。500 plの注入量は0.1 mmです。
6. インキュベーターから胚の皿を取り出し、胚皿に約5mLの0.2%トリカインを加えて麻酔をかけます。
7. 完全な麻酔を確実にするために、胚マニピュレーターツールの先端で胚にそっと触れます。動きがないことは、十分な麻酔がかかっていることを示しています。
8. 麻酔が成功したら、トランスファーピペットで胚を射出成形金型に移します。
9. 各胚を型の異なるウェルに操作し、頭をウェルの最も深い領域に配置して、体幹がくぼみに沿って静止し、尾がくぼみから突き出
るようにします。
10. 充填した針をマイクロマニピュレーターに挿入し、針先を胚の隣に置きます。
11. ジョイスティックを前方に動かして針を尾血管にそっと挿入し、フットペダルを踏み込んでマイクロインジェクションを行います
    手記：注入が成功したかどうかは、液体が循環するのを見ることで測定できます。さらに、腎毒性物質と蛍光標識デキストランの同時注射により、研究者は処置後に成功した注射を確認できます。
12. ジョイスティックをゆっくりと引き戻して、胚から針を取り出します。
13. 注入後、胚を清潔な皿に移し、すすぎをしてトリカインを取り除き、新鮮なE3 / PTUと交換します。
14. 胚を所望の時点までインキュベートして形態を評価し、メチルセルロース封入培地での写真撮影によって文書化したり、必要に応じて実験的分析のプロセスで文書化することができます。
    手記：胚の回復を評価して、浮腫のある個人の割合を決定する必要があります。これは一般的に腎障害を示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化ナトリウム	アメリカンバイオアナリシス	AB01915
塩化カリウム	アメリカンバイオアナリシス	AB01652
硫酸マグネシウム	シグマ・アルドリッチ	M7506
塩化カルシウム	アメリカンバイオアナリシス	AB00366
N-フェニルチオ尿素(PTU)	アルドリッチケミストリー	P7629
3-アミノ安息香酸エチル(トリカイン)	フルカ・アナリティカル	A5040 (英語)
ホウケイ酸ガラス	サッターインスツルメンツ株式会社	BF100-50-10
フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー	サッターインスツルメンツ株式会社	月P097
ウルトラピュアアガロース	インビトゲン	〒15510-027
ファルコンディポーザブルペトリ皿、滅菌、コーニング:
60 mm x 15 mm	VWRの	25373-085
100 mm x 15 mm	VWRの	25373から100
マイクロインジェクショントレイ 150 mm x 15 mm	VWRの	25373から187
低温インキュベーター	フィッシャーサイエンティフィック	11 690 516DQ
マイクロ解剖ピンセット	ロボズ外科用器具株式会社	RS-5010
マイクロメートル	テッド・ペラ社	2280から24

型