腎臓フラットマウントの準備:成体のゼブラフィッシュ腎臓の顕微鏡分析のためのフラットマウントを解剖して準備する手順

要約

出典:McCampbell, K. K. et al.成体ゼブラフィッシュ腎臓におけるネフロン組成と機能の解析。J. Vis. Exp. (2014年度)

このビデオは、成虫のゼブラフィッシュ腎臓のフラットマウントの解剖と準備を示しています。準備されたフラットマウントは、標本分析のために顕微鏡で視覚化することができます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 近位尿細管の蛍光デキストラン標識を可視化するための未固定動物サンプルからの成体ゼブラフィッシュ腎臓の解剖とフラットマウント調製

1. デキストランを注入した成魚のゼブラフィッシュを、0.2%トリカインpH7.0の皿に4〜5分間入れて安楽死させます
   手記：鰓の動きが止まり、心臓の鼓動が止まったかどうかを注意深く監視することにより、魚が安楽死させられたことを確認してください。
2. プラスチックのスプーンを使用して、魚をトリカイン溶液から持ち上げ、溶液をデカントして、動物をティッシュまたはペーパータオルの上に置きます。
3. 鋭利な解剖ハサミを使用して、鰓蓋の後ろに切り込みを入れ、頭を取り除きます。
4. すぐに解剖ハサミで魚の体を開き、頭から尾びれの付け根まで腹側に長い切開をします。
5. 一対の細い鉗子を使用して魚の内臓を取り除きます。
6. 極細の解剖針を使用して体壁をピンで開き、動物の背壁に付着している腎臓器官を視覚化できるようにします。
7. 細い鉗子を使用して、腎臓を背壁から取り外します。
8. 1X PBSが入った5mLのガラスバイアルに腎臓をそっと入れ、3〜5mLの新鮮な1X PBSでそれぞれ5分間3回洗浄します
   手記：成人の腎臓サンプルの取り扱いにガラスバイアルを使用すると、組織の可視化が容易になり、約3〜5 mLの大容量(組織質量に対して)での洗浄が可能になります。あるいは、12ウェル細胞培養皿を使用することもできます。プラスチック製の微量遠心チューブを使用することもできますが、標準サイズのチューブ(1.5mL)では洗浄が制限される可能性があります。
9. トランスファーピペットで腎臓を取り出し、1X PBSを1〜2滴垂らした清潔なスライドガラスの上に置きます。
10. 細い鉗子を使用し、スライド上の腎臓を平らにし、組織がカールしたり、それ以外の方法でそれ自体がひっくり返ったりしていないことを確認します。
    手記：あるいは、タングステンワイヤーツールを使用して結合組織に小さな切開を行い、腎臓の平坦な位置決めを容易にすることもできます。
11. 18 x 18 mmのガラスカバースリップの各コーナーにモデリングクレイの小片を置き、カバースリップを腎臓にゆっくりとセットします
    手記：配置時にはカバーガラスをわずかに傾けて、溶液中の気泡の捕捉を最小限に抑えます。モデリング粘土のディボットの直径は約2mmです(図1A)。あるいは、モデリング粘土の代わりに真空グリースのディボットを置き換えることもできます。必要に応じて、カバーガラスとスライドガラスの間のスペースを埋めるために、1X PBSをさらにドロップします。
12. スライドガラスを実体顕微鏡または複合顕微鏡の視野に置き、適切なフィルターを使用して腎臓を観察および/または画像化します。

結果

図1.成魚のゼブラフィッシュ腎臓フラットマウントの調製と適用により、腎臓ネフロンのPCTセグメントにおける抱合型デキストランの取り込みを視覚化します。(ア)腎臓標本フラットマウント製剤の明視野画像で、臓器がスライドガラス上に平らに配置され、モデリング粘土(ホットピンク色)の4つのディボットに載っている組織の上にカバースリップが置かれています。ここでは、腎臓製剤をメートル法の定規と一緒に画像化し、スケールで比較します。典型的な成人の腎臓は、頭から尾まで約5〜7ミリメートル(mm)です。 黒色の色素沈着は、腎臓に関連して見出されるメラノサイトの散在する集団に対応し、大動脈は腎臓の正中線に沿って走っています。(C) 40 kDa デキストランフルオレセイン (FITC) の腹腔内注射の 3 日後、成人の腎臓を漂白せずにネフロン PCT...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1X PBSの			蒸留水で10 X PBSを希釈して作られます。
ファイン鉗子	ロボズ	RS-1050	デュモンピンセットパターン#55
スライドガラス	サーモフィッシャー	4445	ホワイトフロスト
ガラスカバースリップ	サーモフィッシャー	12-540A	18 x 18ミリメートル
モデリング粘土	ハズブロ	プレイドー	他のモデリングクレイを代用して、同様に機能させることができます。
スライドホルダー	サーモフィッシャー	12〜587	オプション:スライドを平らに保管するための段ボールトレイ。
実体顕微鏡	ニコン	SMZ645;SMZ1000;83455 P-ブルーGFP / DAPI;83457 P-Endow GFP / FITC;83457 P-TRITCの	使用したフィルターセットは次の通りでした:Hoechst/DAPIフィルターは、DAPI、ヨウ化プロピジウム、デキストランカスケードブルー、およびアルカリホスファターゼの検出に使用されました。GFP/FITCフィルターは、デキストラン-FITC、デキストランルシファーイエロー、および抗GFPの検出に使用されました。TRITCフィルターは、デキストラン-フルオロ-ルビー、PI、およびDBAの検出に使用されました。
複合顕微鏡	ニコン	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C テキサスレッド	使用したフィルターセットは次の通りでした:Hoechst/DAPIフィルターは、DAPI、ヨウ化プロピジウム、デキストランカスケードブルー、およびアルカリホスファターゼの検出に使用されました。GFP/FITCフィルターは、デキストラン-FITC、デキストランルシファーイエロー、および抗GFPの検出に使用されました。Texas Redフィルターは、デキストラン-フルオロ-ルビー、PI、およびDBAの検出に使用されました。