ゼブラフィッシュ腎臓の色素脱失と染色:成体ゼブラフィッシュ腎臓の染色準備技術

要約

出典:McCampbell, K. K. et al.成体ゼブラフィッシュ腎臓におけるネフロン組成と機能の解析。J. Vis. Exp.(2014年)

このビデオでは、成魚の腎臓の色素脱失とその後の染色手順の準備を示しています。染色後、成体のゼブラフィッシュの腎臓は、腎臓の再生、腎疾患モデルの表現型の特徴付け、およびネフロンの機能の研究に使用できます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 成体ゼブラフィッシュ腎臓の固定、解剖、透過化、色素沈着の除去

1. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)/1X PBS/0.1% DMSOの新鮮な固定液を調製するか、4% PFA/1X PBSの凍結アリコートを解凍し、0.1% DMSO.
   を添加します。 注意:PFAは有毒であるため、PFA溶液は、手袋や白衣などの適切な個人用保護具を着用しながら、化学フードで取り扱う必要があります。また、PFA粉末は原液を作る際に取り扱いに注意が必要です。
2. 解剖トレイに十分な固定液を入れて、動物全体を水没させます。
3. 選択したゼブラフィッシュを安楽死させ、固定液にマウントします.
   手記： 選択される魚類は、未処理のゼブラフィッシュ腎臓標本、または以前に腹腔内デキストラン注射を受けたゼブラフィッシュから単離された腎臓であり得る。
4. サンプルO/N(12〜16時間)を4^°Cに固定します。
5. 翌日、細い鉗子を使用して腎臓を背側体壁から慎重に取り外し、トランスファーピペットを使用して臓器をガラスバイアルに入れます
   注:あるいは、12ウェルまたは24ウェルの培養皿を使用することもできます。プラスチック製の微量遠心チューブを使用することもできますが、標準サイズのチューブ(1.5mL)では洗浄が制限される可能性があります。
6. 解剖した腎臓を3〜5 mLの1X PBSと0.05%Tweenでそれぞれ5分間3回洗浄します。
7. 1X PBSを0.05% Tweenで取り出し、3 mLの5%ショ糖溶液(1X PBS中)で腎臓を30分間すすぎます。
8. 3 mLの30%ショ糖溶液(1X PBS中)と交換し、O / N(12〜16時間)を4^°Cで保存します
   注:スクロース溶液は細胞膜を透過し、その後、試薬が組織に浸透するときに試薬の特異的な標識が可能になります。
9. 翌日、30%ショ糖溶液を取り出し、0.05%Tweenを含む5 mLの1X PBSで腎臓を2回、それぞれ5分間洗浄します。
10. 1X PBSを0.05%Tweenと交換し、3〜5 mLの漂白液で腎臓臓器に存在するメラノサイトの色素沈着を除去します。
11. ガラスバイアルをローテーターに置き、色素沈着が消えるのを注意深く観察します.
    注:スクロース治療後に行うと、通常、色素脱失には約20分かかりますが、場合によっては60分ほどかかることもあります。漂白液を腎臓に長時間放置すると、臓器の崩壊が発生する可能性があります。組織の完全性をチェックするために、10〜15分ごとにサンプルをモニタリングすることをお勧めします。
12. 腎臓から色素沈着が除去されたら、0.05%トゥイーンを含む3〜5mLの1X PBSで2回洗浄します。
13. 1X PBSを0.05% Tweenと交換し、3〜5 mLの4% PFA溶液を室温で1時間
溶解します。
14. 4% PFA 溶液を取り出し、0.05% Tween を含む 1X PBS 3-5 mL で腎臓を 3 回洗浄します。
    注:固定が完了したら、腎臓をスライドガラスに取り付けて、メラノサイトの色素沈着なしにデキストランの取り込みを評価することもできます。
15. 1X PBSを0.05%Tweenで取り除き、3〜5 mLのブロッキング溶液と交換し、次いで腎をRTでブロック内で2時間インキュベートします。
16. ブロッキングが完了したら、選択した染色プロトコルに直接進んでください
    注:腎臓は、さまざまな試薬で標識研究を実施するために、1つ以上の他の手順で処理できるようになりました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1X PBSの			蒸留水で10倍PBSを希釈して作られます
1X PBSTの			0.1% Tween-20 洗剤 1X PBS 溶液
1X PBS、0.05 % トゥイーン			0.05% Tween-20 洗剤 1X PBS 溶液
トゥイーン 20	アメリカンバイオアナリシス	AB02038
4% PFA/1X PBS			4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat #19210) を1X PBSに溶解し、ドラフト内のホットプレートで沸騰させます。アリコートを冷やして-20°Cの冷凍庫に保管し、使用直前に解凍し、ストックを再凍結しないでください
漂白剤			漂白剤ミックス処方(20 ml溶液用):1.6 mlの10%水酸化カリウム溶液0.6 mlの30%過酸化水素溶液100 μlの20%トゥイーン蒸留水で20 mlまで充填します
水酸化カリウム	シグマ	221473
過酸化水素	シグマ	H1009
ブロッキングソリューション			ブロッキング溶液(10 mL溶液用):1X PBS8 mLと0.05% Tween、子牛胎児血清2 mL、DMSO150 μl