拡張病理学:臨床組織サンプルの高解像度光学イメージング法

要約

出典:Klimas, A. et al. 物理的および等方的拡大によるヒト組織切片のナノスコピックイメージング。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、拡張顕微鏡法の一種である拡張病理学と呼ばれる方法について説明しています。この方法では、ナノスケールの構造を顕微鏡で観察するために、ポリマーネットワークを使用して臨床組織標本を化学的に膨張させます。

プロトコル

1. 試料のin situ重合

1. 試料を固定溶液でインキュベートします。
   1. AcXストック溶液を1x PBSで希釈し、非アルデヒド固定剤で固定したサンプルの場合は0.03 mg/mL、アルデヒド固定剤で固定したサンプルでは0.1 mg/mLに希釈して、アンカリング溶液(通常、組織切片を覆うのに十分)を調製します。これは、AcXと反応できる遊離アミンが少ないアルデヒド固定剤で固定されたサンプルの場合です。
   2. スライドを100mmのペトリ皿に入れ、固定液を組織の上にピペットで固定します。室温で少なくとも3時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
2. サンプルをゲル化溶液中でインキュベートします。
   1. 少なくとも100倍の余剰量のゲル化溶液を調製します。200 μLにつき、モノマー溶液188 μL、0.5% 4HT原液4 μL(1:50希釈、最終濃度0.01%)、10% TEMED原液4 μL(1:50希釈、最終濃度0.2%)、10% APS原液4 μL(1:50希釈、最終濃度0.2%)を順に組み合わせます。
      注:ゲル化溶液は使用直前に作る必要があります。溶液は4°Cに保ち、APS溶液は最後に添加して、早期のゲル化を防ぐ必要があります。
   2. ティッシュ切片から余分な溶液を取り除き、スライドを100mmのペトリ皿に入れます。新鮮な冷たいゲル化溶液をサンプルに加え、混合物を組織上で4°Cで30分間インキュベートして、溶液を組織に拡散させます。
3. サンプルの周りのスライド上にチャンバーを構築します(図1A)ゲル化溶液を乱さずに。
   1. ダイヤモンドナイフを使用してカバーガラス片を薄く切断することにより、ゲル化チャンバーのスペーサーを作成します.
      注:拡張後のイメージングを容易にするために、スペーサーの厚さを組織標本に近づけて、組織の上のブランクゲルの量を減らす必要があります。Number 1.5ガラスは、標準的な臨床サンプル(5-10μm)に使用できます。カバーガラス片を積み重ねて、より厚いサンプルにすることができます。
   2. 水滴 (~10 μL) を使用して、組織の両側にスペーサーを固定します。
   3. カバーガラスの蓋をスライドの上に慎重に置き、組織の上に気泡が閉じ込められないようにします(図1B)。
4. サンプルを37°Cの加湿環境(湿らせたワイプ付きの密閉型シャーレなど)で2時間インキュベートします
   注:プロトコルはここで一時停止できます。スライドチャンバーは、密閉されたペトリ皿内に4°Cで保管できます。

2. サンプルの分解

1. カミソリの刃をカバースリップの下にそっとスライドさせ、カバースリップをゲル表面からゆっくりと持ち上げて、ゲル化チャンバーのフタを取り外します。ティッシュの周りのブランクジェルをトリミングして、ボリュームを最小限に抑えます。ホモジナイズ後のゲルの向きを追跡するために、ゲルを非対称にカットします。これは、サンプルが透明になるためです。
   1. 使用前に、ProKを消化バッファー(最終濃度4 U/mL)で1:200に希釈してください。ゲルを完全に沈めるのに十分な溶液を準備します。4ウェルプラスチック細胞培養プレートの1ウェルには、ウェルあたり少なくとも3 mLが必要です。
   2. サンプルを分解バッファーの入った密閉容器で60°Cで3時間インキュベートします。分解中にサンプルがスライドから外れない場合は、カミソリの刃を使用してサンプルを静かに取り出します.
      注:サンプルが乾燥するのを防ぐために、試料を分解バッファーに完全に浸し、フィルムで密封できる蓋付きの容器(小さなスライドボックス、プラスチックウェル、シャーレなど)に入れる必要があります。

3. サンプルの膨張とイメージング

1. 柔らかい絵筆を使用して、目的のイメージングシステムと互換性があり、完全に膨張したゲルを収容するのに十分な大きさの容器で、標本を1x PBSに移します。倒立系でイメージングする場合はサンプル側を下にして、直立系でイメージングする場合は上向きにして、イメージング対物レンズからサンプルまでの距離を最小限にしてください。必要に応じて柔らかい絵筆を使用してゲルを裏返します.
   手記： LEDからの側面照明を使用して、液体でそれらを見えるようにすることができます。標準的な6ウェルプレートは、事前に拡張された直径が0.6cm未満のサンプルを収容できます。ガラス底ウェルプレートは、倒立システムでのイメージングに使用する必要があります。
2. サンプルを1x PBSで室温で10分間洗浄します。必要に応じて、分解プロセスでDAPI染色が洗い流されるため、サンプルを300 nM DAPIで再染色します。PBSを除去し、1x PBSで希釈した300 nM DAPIでRTで20分間染色した後、1x PBSでRT.
   で10分間洗浄します 注:サンプルを1x PBSで覆い、4°Cで保存してから次のステップに進むことができます。
3. サンプルを拡大するには、PBSを交換し、過剰量のddH₂O(最終ゲル容量の少なくとも10倍)と3〜5回、それぞれ10分間、RT.
   で洗浄します 手記： 3^回目または4^回目の洗浄後、標本の拡張は横ばいになり始めるはずです。保存のために、細菌の増殖を防ぐために、ddH₂Oに0.002%−0.01%のアジ化ナトリウム(NaN₃)を補充することができる。この場合、最終的な膨張係数は可逆的に10%減少します。
4. 従来の広視野顕微鏡、共焦点顕微鏡、またはその他の選択したイメージングシステムを使用して蛍光イメージングを実行します.
   手記： ゲルの漂流を防ぐために、余分な液体をウェルから取り除くことができます。ゲルは、1.5-2%の低融点アガロースで固定化することもできます。1.5-2%(w/v)の低融点アガロースを水溶液の2-4倍の容器に調製します。溶液を40°Cのウォーターバスまたは電子レンジで10〜20秒間温め、溶液を溶かします。溶かしたアガロースをゲルの端の周りにピペットで動かします。アガロースを室温または4°Cで硬化させた後、脱水を防ぐためにサンプルに水を加えます。

結果

図1:病理サンプル用のゲル化チャンバー (A) ダイヤモンドナイフでカットした#1.5カバーガラスの2枚などの2つのスペーサーを、サンプルを4°Cのゲル化溶液でインキュベートした後、組織の両側に配置します。スペーサーは、サンプルの圧縮を防ぐために、組織スライスよりも厚くする必要があります。(B)#1.5カバーガラスなどの蓋を使用して、37°Cでインキュベートする前にサンプルを覆います。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6ウェルガラス底板(#1.5カバーガラス)	セルビス	P06-1.5H-N
アセトン	フィッシャー・サイエンティフ	A18-500
アクリルアミド	シグマ・アルドリッチ	A8887
アクリロイル-X SE、(AcX)	インビトゲン	A20770 (英語)
アガロース	フィッシャー・サイエンティフ	BP160-100
過硫酸アンモニウム(APS)	シグマ・アルドリッチ	A3678の	イニシエータ
DAPI(1 mg / mL)	サーモサイエンティフィック	62248	核の汚れ
ダイヤモンドナイフ No.88 CM	一般的なツール	31116
エタノール	Pharmco(ファーマコ)	111000200
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)0.5 M	VWRの	BDH7830-1
FFPE腎臓サンプル	USBオマックス	HuFPT072
鉗子
マイクロカバーガラス#1(24 mm x 60 mm)	VWRの	48393 106
マイクロカバーガラス#1.5(24 mm x 60 mm)	VWRの	48393 251
N、N、N'、N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)	シグマ・アルドリッチ	T9281	アクセル
N,N'-メチレンビスアクリルアミド	シグマ・アルドリッチ	M7279
Nunclon 6ウェル細胞培養ディッシュ	サーモフィッシャー	140675
Nunc 15 mL コニカル	サーモフィッシャー	339651
Nunc 50 mL コニカル	サーモフィッシャー	339653
オービタルシェーカー
ペイントブラシ
pHメーター
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)10x溶液	フィッシャー・サイエンティフ	BP399-1
プラスチックシャーレ(100 mm)	フィッシャー・サイエンティフ	FB0875713
プロテイナーゼK(分子生物学グレード)	サーモサイエンティフィック	EO0491
カミソリの刃	フィッシャー・サイエンティフ	12640
Safelock 微量遠心チューブ 1.5 mL	サーモフィッシャー	3457
Safelock 微量遠心チューブ 2.0 mL	サーモフィッシャー	3459
アクリル酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	408220
塩化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S6191
クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物	シグマ・アルドリッチ	C8532-1KG
トリスベース	フィッシャー・サイエンティフ	BP152-1
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	T8787
キシレン	シグマ・アルドリッチ	214736