マウス糸球体からの体液吸引:2光子媒介マイクロパンクチャーを用いたマウスからの糸球体液吸引法

要約

出典:Matsushita, K. et al. 2光子顕微鏡によるマウスのボウマン空間のマイクロパンクチャー。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、2光子媒介マイクロパンクチャー技術を使用して、マウス糸球体からの流体吸引を紹介しています。この技術は、生きたマウスの糸球体へのアクセスを提供し、腎臓の生理学に関する洞察を得るのに役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 新しい外科的処置による流体イメージングカラムの下の腎臓へのラテラルピペットアクセス

>注:イメージングサポートシステムと外科的準備の組み立てを図1に示します。記載されている手順は、体重20〜25gのC57BL/6マウスで行います。

1. マウスの重量を量ります。
2. 4%イソフルランを使用して麻酔を誘発し、空気/酸素混合物中に1.5〜2.5%イソフルランを維持します。.マウスが痛みを伴う刺激に対する反応がなく、呼吸数が減少することにより
麻酔がかかっていることを確認します。
3. 目に注油し、動物をベースプレートの側面に配置します。テープを使用して4つの四肢を固定します。
4. 生理食塩水200μLを皮下に注入し、直腸温プローブを留置します。手術中はヒーティングランプ、イメージング中はヒーティングパッドを使用して温度を制御します。
5. 脱毛クリームを使用して、マウスの左側のすべての毛を取り除きます。
6. 皮膚の下に見える脾臓の位置を特定し、脾臓の背側と尾側に左腎臓を配置します。
7. 皮膚に0.5cmの切開を行い、腹膜に小さな切開を行い、腎臓が簡単に押し通すのに十分な長さにします。
8. 穏やかな圧力で腎臓を押し出します。ポリシロキサンで作った腎臓安定剤の型を腎臓の周りに置き、シアノアクリレート接着剤で固定します。腎臓の最も外側の表面がスタビライザーから約1mm伸びるように、腎臓をスペーサーに並べます。
9. ヘッドプレートをスタビライザーフォームに接着剤で固定し、ベースプレートの取り付けバーにヘッドプレートを取り付けます。
10. 腎臓を囲むポリシロキサン支持体にウェルを1%アガロース溶液で満たし、10 mmのカバースリップを上に置き、アガロースが固まるまで保持します。カバースリップを接着剤でヘッドプレートに密封し、デンタルセメントでカバースリップの周りにリングを作成します。
11. FITC-デキストラン(2,000,000 Da、5%溶液、100–150 μL)を眼窩後方に注入し、マウスと固定プレートを2光子顕微鏡ステージにすばやく移動させ、麻酔を維持し、顕微鏡ステージで十分な廃ガス掃気を確保します。

2. 適切な糸球体の選択とボウマンのスペースへのピペットアクセス

1. 定義：
   1. Xを画面上で左右に、顕微鏡を向いて左右に定義
   します
   2. ステージコントローラーからSX(ステージX)を読み取る
   3. PXをピペットXとして定義します、ピペットダイヤルコントローラーで
   4. Yを画面上で上下に定義し、顕微鏡に向かって前進し、2光子セットアップに向かって戻ると定義
   します
   5. Z を天井に向かって上、床に向かって下、ステージ上で目標の Z 位置で測定するように定義します。
   6. S(O)Z をステージ (実際には目標) の高さとして定義します。
2. 眼球の緑色蛍光タンパク質(GFP)フィルター設定を使用して識別可能な腎臓の表面を見つけます。FITC-デキストランの注射により、血管系は明るい緑色になります。
   1. 適切な糸球体を特定します。眼球を使用して腎臓の表面を特定した後、2光子(非スキャンモード)に切り替えて、イメージングウィンドウを探索します。マイクロパンクチャーの好ましい特性は、カバーガラスの下の垂直距離>30μm(アクセス中のピペットとカバースリップの衝突を防ぐため)と外側腎臓嚢から糸球体までの横方向距離<400μm(この距離を超えると、ピペットの偏差がミスの可能性を高める可能性があります)です。
3. 穿刺点、つまり腎嚢上の糸球体のピペット側に直接到達する点までの横方向および垂直方向の距離を記録します。
4. 対物レンズの焦点を水柱に上げ、xステージとyステージの座標を約1センチメートル変更しません。
5. ピペットの先端を水柱に打ち込み、4',6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール(DAPI)励起をオンにします。ピペットをx次元とy次元で先端の最大蛍光点まで動かすと、これが対物レンズの中心になります。眼球でピペットを見つけることは、この正確な事前配置なしには困難です。量子ドットは励起波長に関係なく同じ波長(この場合は赤色)で蛍光を発するため、DAPI励起は赤色蛍光を生成し、図2に示すように先端に密集します。
6. 励起設定を赤色蛍光タンパク質(RFP)に変更し、ピペットを眼球で視覚化してから、ピペットを眼球ビューの中央に正確に配置します。
7. 2光子に切り替えて、2光子の下のピペットを見つけて、画像の中央に正確に配置します。これが登録ポジションです。
8. ピペットの画像を保存します。
9. ステージとマイクロピペットコントローラーの座標を登録します.
   手記：JavaScriptコードを使用して計算を実行する補足.htmlファイル(スプレッドシートソフトウェアがインストールされていないシステムに適しています)またはスプレッドシートを使用して、ステージとピペット座標の間のオフセットを計算し、ピペットコントローラーのターゲット座標を計算します。
10. ピペットをX軸の水柱から取り外し、zとyを同じに保ちます。
11. ピペットZをターゲット糸球体Zに移動します(つまり、ピペットをカバーガラスの下のZ方向に下に移動します)
12. ピペットYを目標糸球体Y座標に移動します。
13. 2光子ライブビューをターゲット糸球体Zに移動し、次に腎臓の端に移動してSXに注意してください。
14. レジストレーションSXからのオフセットを使用して、キドニーエッジPXを計算します。
15. ステージをピペットに向かって動かします(SXを上げます)腎臓の端が画面の左に来るようにしますが、それでも見えます。
16. ピペットを、上記で計算したキドニーエッジPXよりも約100μm小さくすばやく進めます。
17. ピペットの先端の位置を確認し、ピペットをゆっくりと進めます。赤のゲインを上げ、赤のピクセルヒストグラムを確認します(量子ドットの極端な明るさとオフターゲット蛍光により、ピペットがウィンドウに画像化される前にピクセル分布がシフトします)。
18. ライブ2光子イメージングの下で腎臓の端まで前進.
    手記：腎カプセルに入る前に、ピペットをY次元とZ次元に方向転換することができます。ただし、これによりピペットの先端が破損する可能性があります。ピペットがターゲットから外れている場合、より保守的な手段は、X次元で最大2 cmまで引き出し、方向転換してから、X次元で腎臓の端に戻ることです。ピペットが組織内に入ると、X軸以外の任意の軸の動きはピペットの屈曲につながり、利用するには豊富な経験が必要であり、頻繁に破損につながります。
19. X軸のピペットをゆっくりとグロムターゲットPXまで駆動し、SXに注意してください。(マイクロピペットを挿入したときに糸球体が少しでもずれているかどうかを確認するために、時々糸球
体に戻ると便利です)。
20. 正しい場所にいたら、z-stack.
    で位置を文書化します。 手記：マイクロピペットを装着した状態で、薬物、タンパク質、または蛍光トレーサーを注入したり、後で分析するために液体を吸引したり、別の電極に対する圧力や電荷を測定したりすることができます。

3. ボウマンの宇宙からの流体の吸引

1. マイクロポンプを100nLのパーフルオロデカリンを2分間注入するように設定して、ピペットの開存性を確保し、エントリー中のピペットの詰まりによる交絡を減らします。ピペットの位置を確保するために再イメージ化します。
2. 追加のろ過のために4〜6分待ちます。
3. マイクロポンプを最大50nL/minの速度で最大300nLまで吸引するように設定します><。 手記：糸球体形態の変化はこの速度では観察されず、吸引中の空間への体液の供給速度は変化しないことを示唆しています。従来のマイクロパンクチャーのようなオイルブロックがないため、質量分析に必要なこのボリュームの回収には、注入されたペルフルオロデカリンの一部と、場合によっては管状流体が含まれる可能性があります。イオン感受性電極測定、蛍光分光法、ポリメラーゼ連鎖反応、その他の高感度エンドポイントなどのアッセイには、少量のものを使用できます。質量分析がエンドポイントでない場合は、鉱油と標準的なマイクロパンクチャー技術を使用して、保存前に吸引量を測定できます。
4. もう一度画像。
5. ピペットを引き出してサンプルを保存し、TRISバッファーを添加し、分析前に-80°で保存します。
6. イソフルランの過剰摂取または他の承認された方法を使用してマウスを安楽死させます.
   手記：濾液は、糸球体毛細血管からのろ過によって空間に入ります。マウスの単一ネフロン糸球体濾過率(SNGFR)は8〜14 nL / minの間で報告されています。しかし、ムクドリの力がSNGFRを支配しており、したがって、ボーマンの空間の負の静水圧がSNGFRを増加させる可能性があります。標準的なマイクロパンクチャ法では、管状流体のサンプリングにオイルと中性圧力による管状ブロッキングを使用しますが、これらの化合物は質量分析に干渉します(以下を参照)。したがって、この技術では、初期の近位尿細管は特許のままです。さらに、吸引時には、ボウマンの空間には不明だが正の量の濾液が含まれています。したがって、流体吸引率はSNGFR.
   を超える可能性があります。 手記：ここで説明する実験では、ナノプロテオミクス技術による質量分析のために、通常よりも大きな糸球体濾液のサンプルを取得することを目標としていました。質量分析法では、鉱物油やワックス(質量分析におけるシグナルノイズを低減する有機分子の複雑な混合物)を含むオイルブロックの使用ができないため、マイクロピペットとシリンジの充填にはペルフルオロデカリンが使用されます。ペルフルオロデカリンは管状の流れを遮断することは知られていませんが、生物学的に不活性であり、質量分析を妨げません。

結果

図1:カスタムサポートと横方向のアクセスのための固定による腎臓の部分的な押し出し。左側には、イメージングカラムと腎臓サポートの部品が示されており、中央に完全なアセンブリがあります。右側には、サポートの適用前(上)と適用後(下)の腎臓の準備が示されています。

図2:プロトコルのピペット登録ステップで完了した腎臓の準備。ここでは、DAPI励起を使用して、マイクロピペットを2光子顕微鏡の水柱内に配置しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
正立2光子顕微鏡	ツァイス	LSM 7メガピクセル
3軸顕微鏡ステージコントローラー	サッター	MP-285
3軸ヘッドステージコントローラー	サッター	MP-225
ピペットホルダー	分子デバイス	1-HL-U
ヘッドステージ	分子デバイス	CV203BU
FITC-デキストラン 2000 kDa MW	シグマ・アルドリッチ	52471から1G
ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ	サッター	B150-110-7.5
マイクロピペットプーラー	サッター	P-97
量子ドット、605 nm	サーモフィッシャー	Q21701MP
ポリシロキサン	スグル		www.sugru.com、「オリジナルフォーミュラ」。どんな色でも。
PE-50チューブ	インステックラボ	BTPE-50
マイクロインジェクター	WPIの	UMP-3
マイクロインジェクターコントローラー	WPIの	マイクロ4
ペルフルオロデカリン	シグマ・アルドリッチ	306-94-5
アガロース	シグマ・アルドリッチ	〒9012*36*6
カバースリップ、10 mm	ハーバード大学装置	〒64-0718
ヘッドプレート	習慣		神経科学研究室では一般的で、多くのサプライヤーが
頭部固定装置	習慣		神経科学研究室では一般的で、多くのサプライヤーが
30Gの針	ベクトン・ディキンソン	125393	眼窩後噴射用
ツベルクリン注射器	ベクトン・ディキンソン	309626	眼窩後噴射用