ニワトリCAM上の腎臓器官型培養:腎血管構造の形成を誘導するためのニワトリCAM上のマウス腎臓外植片の移植技術

要約

出典: Kaisto, S. et al. Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、鳥類の胚から絨毛膜(CAM)に改良された異種移植セットアップを使用して臓器の発達を研究する方法を説明しています。この方法により、完全に血管新生された培養胚器官およびオルガノイドの発生が可能になります。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています

1. ニワトリCAM上でのマウス胚性腎臓および腎臓オルガノイドの培養用ミニリザーバーの作製と異種移植実験の準備

1. 6ウェルまたは12ウェルプレート用に設計されたトランズウェル細胞培養インサートを使用してください.
   手記：特定の実験に応じて、大小のミニリザーバーを使用することができます。最大8つの胚性腎臓の異種移植や、複数のミニリザーバーを同じニワトリ胚に配置する場合(例えば、同じニワトリCAMでの実験と対照サンプル)には、小さなミニリザーバーを使用するのが最善です。
2. 丸鋸刃またはハンドソーを備えた回転マルチツールを使用してインサートの側面を切り取り、透過性メンブレンが取り付けられた高さ2mmのプラスチックリングを作成します。
3. これらのミニリザーバーの端をメスまたは鋭利なナイフで磨きます。
4. ミニリザーバーを70%エタノールで少なくとも1時間滅菌します。
5. ミニリザーバーをオートクレーブ処理した二重蒸留水で洗浄し、層流フードで乾燥させます。
6. PBSと培地(高グルコースDMEM / 10%FBS / 1%ペニシリン-ストレプトマイシン)でミニリザーバーをすすぎます。.
7. リザーバーをシャーレに置き、膜を上にして、液滴(600μL / 400μL)の培養培地の上に置きます。
8. 解剖したex vivo胚性腎臓または腎オルガノイドを、ピペットまたはガラスキャピラリーチューブを使用して、膜上に均等に配置します。腎臓の周りに大量の液体を残さないでください。
9. サンプルを細胞培養インキュベーターで2〜24時間、37°Cおよび5%CO₂.
   でメンブレンに付着させます 手記：最大8つのE11.5胚性マウス腎臓または腎臓オルガノイドを小さなインサートに配置できます。大きな胚組織片を異種移植に使用する場合、またはCAMのより広い領域に細胞-ハイドロゲル混合物を使用する場合は、大きなインサートが推奨されます。
10. 以前に発表された方法に従って調製された生後8日間のex ovo培養胚ニワトリを細胞培養インキュベーターから取り出し
ます
11. ミニリザーバーをCAMに移して、グラフトがCAMに面し、メンブレンがそれらを覆うようにします。ミニリザーバーをCAMの周辺に配置して、鶏の胚を覆わないようにします。
    手記：12ウェルプレート用のトランズウェルインサートから製造された小型のミニリザーバーを使用する場合、1つのCAMに最大3つのミニリザーバーを配置できます。
12. 500 μL(6ウェルインサート)または300 μL(12ウェルインサート)の培地をミニリザーバーに加えます。
13. サンプルをチキンCAMで最大9日間培養します。ミニリザーバーの培地を毎日交換してください.
    手記： サンプルの血管新生は、移植後24〜48時間で観察できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
セルインキュベーター	パナソニック	13090543	温度は37°C、湿度90%、CO₂5%に設定
セルインキュベーター	山陽電機	10070347	チキンCAM培養インキュベーター。温度は37°C、湿度90%、CO₂5%に設定
ダルベッコのモディファイドイーグルのミディアム	シグマ	D777	高グルコース
エタノール(70%)	VWRの
ウシ胎児血清	ハイクローン	SH3007003HI サーモサイエンティフィック
鉗子デュモン#5	デュモン	#5SF
PBSの-/-	コーニング	20-031-履歴書
PBSの+/+	バイオウエスト	X0520-500	ミニリザーバーを洗う。
ペニシリンとストレプトマイシン	シグマ	P4333
Thincert 12ウェル細胞培養インサート、0.4 μmポアポリスチレンメンブレン	グライナーバイオワン	665641
Thincert 6ウェル細胞培養インサート、0.4 μmポアポリスチレンメンブレン付き	グライナーバイオワン	657610