外科的大槽注射:マウスモデルの中枢神経系に腫瘍細胞を直接投与する方法

要約

出典:Law, V. et al.軟髄膜疾患の直接標的療法を研究するためのマウスOmmaya異種移植モデル。J. Vis. Exp.(2021年)

この動画では、ヒト由来の腫瘍細胞をマウスの脳の大槽に送達する手順を説明しています。同所性マウスモデルを使用して、がんの頭蓋髄膜への転移性転移を研究することができます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. CTCの準備

1. 注射に必要なCTCの数を計算し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1.0 × 10⁴細胞/μLのシングルセル懸濁液を調製します。細胞懸濁液を氷上または手順全体を通して4°Cに置きます.
   手記：トリプシン化が必要な細胞株を使用する場合は、必ず滅菌PBSで細胞を2回洗浄してトリプシンを除去してください。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞カウントを行います。大規模なコホート(>50匹のマウス)を使用する場合は、細胞を再カウントし、注射間の細胞生存率を検証して、マウスごとに一貫した数の細胞が投与されるようにします。

2. 術前処置

1. マウスに5 mg / kgのブプレノルフィン徐放性(Bup-SR)を皮下注射します。.
   手記：提案された切開部の領域を注入しないでください。肩甲骨から十分に離れた注射部位を選択してください。
2. マウスに2〜3%イソフルランを麻酔し、立ち直り反射の兆候がなくなるまで麻酔します。さらに、尻尾や足の挟み込み反射をチェックして、麻酔の状態を確認します。
3. 手術エリアから離れた場所でマウスを手術の準備をします。手術部位(つまり、頭蓋骨の背側表面)を、毛皮が切開部位を汚染しないように十分な境界領域でクリップします。次に、サイトの中心から周辺に向かって作業する殺菌性皮膚消毒剤でサイトを飽和させ、乾燥させます。滅菌ドレープまたは滅菌接着剤で裏打ちされたプラスチックドレープ材料を適用して、手術部位を汚染から保護します。
   手記：器具は事前にオートクレーブ滅菌し、ガラスビーズ滅菌器を使用して動物間で先端を再滅菌する必要があります。
4. 頭の腹面全体の毛皮を剃り、滅菌技術を使用して皮膚を準備します。
5. 定位装置の改良型L字型ノーズコーンで鼻を固定し、鼻孔がクリアで開いたままになるようにします。両方の耳介の腹面にテープを使用して、皮膚をゆっくりと前方に引っ張って鼻円錐に固定し、固定したら首を約90°の角度で曲げます。麻酔を維持するために1.5%イソフルランを投与します.
   手記：適切な位置決めにより、切開領域は、後頭骨の尾側隆起を簡単に識別できる方法で提示されます。
6. 背骨が大槽と同じ高さになるように体を配置し、尾にわずかな牽引力を加えながら、尾の付け根にテープを貼って固定します。

>3.外科用槽マグナ注射

1. 首を完全に伸ばし、耳介の間から開始して、手術用ハサミの先端を後頭骨全体にわずかな圧力で下向きに動かします.
   手記：この正中線の位置にいる間、はさみの先端が大槽の上の凹面領域に浸ると、小さなくぼみが目立ちます。
2. 触診された凹面のすぐ上に小さな3〜5mmの正中線切開を行います。1.0 × 10⁴細胞/μL(合計5.0 × 10⁴細胞)で5 μLの細胞懸濁液を30 Gのハミルトンシリンジに引き込みます。
3. 先端が1〜2mmの鈍い鉗子を使用して、大槽を優しく押し下げます。閉じた位置にチップを導入し、硬膜に下向きの圧力をかけながら開きます。
4. 前のステップで説明した鈍的解剖を繰り返して、硬膜が容易に識別され、関連する血管が露出領域に見えるようになるまで
   手記：その結果、注射ウィンドウにより、針の挿入中に血管が損傷を受けないようにすることができます。
5. 鉗子を開いたままにして周囲の筋肉組織を引っ込めながら、硬膜の下に30Gの非コアリング針を導入して斜角を視覚化します。針がベベル自体のすぐ後ろにのみ挿入されていることを確認してください。シリンジプランジャーをゆっくりと展開し、硬膜のすぐ下に細胞を送達します。
6. ベベルを適切に配置して、硬膜の下の注射を観察します。技術を慎重に管理し、30 Gの非コアリング針を使用して、メンブレンの損傷を防ぎ、漏れを最小限に抑えます。漏れが見られる場合は、綿の先端のアプリケーターでやさしく圧力をかけます。.
7. 傷口クリップまたは皮膚接着剤のマイクロドロップを塗布して皮膚を閉じます。注射が成功したら、マウスが暖かい毛布の上で麻酔から回復するのを待ち、マウスが胸骨の位置を維持し、意図的な動きを示すことができるまでマウスを継続的に観察します。
8. 手術後の最初の1週間は、マウスを毎日監視します。マウスが痛みや苦痛を感じているように見える場合は、獣医の診察と指示に基づいて、12〜24時間ごとに最大5日間、10 mg / kgのカルプロフェン皮下注射で治療します。.マウスが回復し、次のステップに進む前に、少なくとも48〜72時間監視するのを待ちます。
   手記：Bup-SRは、先制的に投与され、最大72時間持続するため、通常、追加の鎮痛薬は必要ありません。ただし、必要に応じて動物に追加の鎮痛薬が提供されます(無気力、食べない場合、フリルの場合)。手術部位に術後感染の兆候(すなわち、発赤、腫れ、圧痛、異痛症、痛覚過敏、過敏症、または化膿)が現れた場合、またはマウスが患部を保護している場合は、マウスを安楽死させます。がん細胞がCSFに正常に注入された場合、LMDと腫瘍の進行は1週間または2週間以内にCNSで進行します(CTCの種類または使用する細胞株によって異なります)(図1)。

結果

図1:軟髄膜疾患と中枢神経系転移を研究するためのマウス異種移植モデルで循環腫瘍細胞を大槽に注入。(A)大槽の位置とCSFアクセス部位を示す図で、CTCはハミルトン注射器を使用して注入されます。(B)軟髄膜疾患を発症し、循環腫瘍細胞を2週間注射した後に中枢神経系転移(脳および脊髄に沿って)を発症したマウスの代表的なIVIS画像。細胞はルシフェラーゼレポーター遺伝子で標識されました。生理食塩水を注射した対照動物は腫瘍を発症せず(n=3)、実験を三重に行った。略語:CTCs =循環腫瘍細胞;IVIS = in vivoイメージングシステム。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ビーズ滅菌器	Braintree Scientific Inc.(または任意のベンダー)	#GER 5287-120V	ジャーミネーター500
ブプレノルフィン徐放性(BUP-SR)	ズーファーム		DEA制御
ハミルトンマイクロリットルシリンジ	ハミルトン		10、25、50、100 μL; 大槽注射用 30G
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	任意のベンダー		0.1 mm 滅菌フィルター
げっ歯類手術器具(はさみ、鉗子)	Roboz Surgical Instrument(または任意のベンダー)
滅菌ブルーペーパー/ドレープカバー	任意のベンダー
滅菌綿スティック	任意のベンダー