マウスにおける脳室内注射:マウス脳の脳室に薬物を送達するためのOmmaya媒介直接薬物投与法

要約

出典:Law, V. et al. 軟髄膜疾患の直接標的療法を研究するためのマウスOmmaya Xenograftモデル。 (2021年)

このビデオは、マウスモデルでのommayaを介した脳室内注射を示しています。この方法は、潜在的な薬剤候補の局所的な送達を可能にし、血液脳関門を回避します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウス・オンマヤの組み立てと移植

1. 駅の準備
   1. ステーションの表面を消毒します。表面に青いカバーを置き、図1に示されているすべての滅菌済みツールと消耗品を準備しておきます。
2. 術前処置
   1. 鎮痛剤(Bup-SR)を塗布し、無菌の手術環境を維持します。
3. マウスオンマヤの外科的移植
   1. 25G (外径 0.51 mm) のミニチュア注入ポートと 1 mm のスペーサーディスクを使用して、Murine Ommaya 注入装置を組み立てます。シアノアクリレート滅菌接着剤を使用して、約 2.5 mm の金属カニューレが右大脳半球に浸透するようにします (図 2A–C)。
      手記：この研究室では、MRI対応のMouse Onmayaのプロトタイプが開発され、すでに両部品(小型注入ポートとスペーサー)が1つのユニットとして3Dプリントされています(図2D)。シングルユニットバージョンはMRIでテストされ、組み立てステップを省くことで時間を節約できます。
   2. 立ち直反射の兆候がなくなるまで、マウスに2〜3%イソフルランを麻酔します。さらに、尻尾や足の挟み込み反射をチェックして、麻酔の状態を確認します。
   3. 毛皮の頭の腹面全体を剃り、滅菌技術に従って皮膚を準備します。マウスをノーズコーンを備えた定位装置に入れて、手順中にイソフルラン投与を継続します。イソフルランを1.5%に減らします。イヤーバーをそっと締めて頭を固定し、マウスの目を覆うようにアイ潤滑剤を塗ります。
   4. 皮膚を小さく切開し(3mm)、続いて下にある皮下組織を鈍く解剖して頭蓋骨を露出させます。過酸化水素を染み込ませた綿先端のアプリケータースティックを使用して頭蓋骨を乾かします。
   5. 頭蓋骨の後ろ0.5mmと横1.1mmのブレグマ(冠状縫合糸が矢状縫合糸によって垂直に交差する頭蓋骨の解剖学的点)にバリ穴を開けます(図2A)、および硬膜を露出させるための0.9mmのバリ穴。マイクロドリルを脇に動かし、シアノアクリレート滅菌接着剤を使用して頭蓋骨に貼り付けた注入口(深さ約2.5mm)を挿入する前に、バリ穴のすぐ周りの骨に優しく傷を付けます。4-0 の吸光性のないナイロン縫合糸を中断縫合パターンまたは財布紐縫合糸で使用して、注入スポットの周囲に縫合糸を留置します。
   6. 手術回復のための個別ケージ内のハウス術後マウス.
      手記：手術で回収した複数のマウスが同じケージに収容されている場合、おそらく絶え間ない改ざん相互作用により、マウスオンマヤが外れる可能性があります。Murine Ommayaを移植したマウスは、薬効試験の期間中、個別に(またはケージごとに2匹以下のマウス)飼育することをお勧めします。.

2. マウスオンマヤ治療

1. Murine Ommyaを使用したマウスの投与
   1. 2〜3%イソフルランでマウスを麻酔し、反射の回復の兆候がなくなるまで麻酔します。さらに、尻尾や足の挟み込み反射をチェックして、麻酔の維持を確認します。
   2. ポートインジェクションアダプターとハミルトンシリンジを使用してMurine Onmayaにアクセスします。鉗子を使用して、ミニチュアインジェクションポートの上部を保持し、ポートインジェクターアダプターをポートのセプタムに完全にそっと挿入します
      手記：ポートインジェクターは、デッドスペースを最小限に抑え、電動シリンジポンプによる制御された注入を可能にする方法でポートのセプタムを貫通します(図3A)。標的治療/新規治療は、麻酔下で1μL/minの流量で注入されます。治療は、研究者の裁量に従って、設定された期間 (週/月) の間、指定された間隔 (毎日/毎週) で行われます
      容量<3μLは信頼性が低く、容量>7μLは圧力がかかりすぎる可能性があるため、3〜7μLの容量が最適です。ハミルトンシリンジのサイズは、各治療アームのマウスの数に応じて、10〜100μLの範囲です。適切な容量をハミルトンシリンジにプリロードすると、シリンジの繰り返し交換が防止され、エラーが最小限に抑えられます。治療アームごとに1本のハミルトンシリンジを専用にするのが最善です。
   3. 注射が終わったら、鉗子を使用してマウスオンマヤをポート注入アダプターから取り外し、マウスをケージに戻して麻酔から回復させます。

結果

図1:マウスにMurine Ommyaを移植するためのワークステーションのセットアップ例(1)ガス麻酔器/気化器。(2)定位固定装置用スタンドを覆う滅菌済みの青い紙のカーテン。(3)脳定位固定装置(スタンド/ステージ、イヤーバー、ノーズコーン)。(4)マイクロドリル。(5)光付き虫眼鏡。(6)滅菌綿先端のアプリケーターは、滅菌生理食塩水リンス容器に貼り付けます。(7)過酸化水素。(8)ビーズ滅菌器。

図2:マウス・オンマヤ装置の埋め込み (A)頭蓋骨上のブレグマの位置を指す矢印と、マイクロドリルを使用してブレグマから頭蓋骨(後方0.5mm/外側1.1mm)にバリ穴が開けられるおおよその距離を示す図。(B)マウスオンマヤは、金属製のカニューレと1mmのスペーサーを頭蓋骨に接着する...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1mmスペーサーディスク	アルゼット、デュレクトコーポレーション	#0008670	スペーサーディスクのみ
4-0 エチロンナイロン縫合糸	任意のベンダー
自動シリンジポンプ	ハーバードシリンジポンプ(または任意のベンダー)	#70-4505	ポンプ11エリート
ビーズ滅菌器	Braintree Scientific Inc.(または任意のベンダー)	#GER 5287-120V	ジャーミネーター500
ブプレノルフィン徐放性(BUP-SR)	ズーファーム		DEA制御
シアノアクリレート滅菌接着剤	任意のベンダー
ガス吸入アネステヒアシステム	VeteEquip(ヴェトエキップ)	#901812	COMPAC5
ハミルトンマイクロリットルシリンジ	ハミルトン		10、25、50、100 μL; 大槽注射用 30G
過酸化水素	任意のベンダー
IVIS 200イメージングシステム	キャリパーライフサイエンス
光付き虫眼鏡	任意のベンダー
マイクロドリル	ストールティング(または任意のベンダー)	#51555M
MRIイメージング	ブルカー	BioSpecシリーズ	随意
Murine Ommaya(MRI対応)プロトタイプ	株式会社インステック研究所	#VAB620-25MRI-3.3
PinPortインジェクター	株式会社インステック研究所	#PNP3M-50
ピンポート	株式会社インステック研究所	#1-PNP3F28-50
げっ歯類手術器具(はさみ、鉗子)	Roboz Surgical Instrument(または任意のベンダー)
脳定位固定装置	ストールティング(または任意のベンダー)	#51730M
滅菌ブルーペーパー/ドレープカバー	任意のベンダー
滅菌綿スティック	任意のベンダー