細胞生物発光ベースのアッセイ:コンビナトリアル薬物スクリーニングのためのハイスループット法

Abstract

出典:Hu, Z. et al.患者由来神経膠腫幹細胞を用いたGBMの併用療法の可能性を特定するための迅速なスクリーニングワークフロー。J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、薬物の高感度かつ迅速なスクリーニングのための生物発光アッセイの有用性を強調する方法について説明します。これらの薬剤は、単独で、または組み合わせて試験して、作用機序の相乗効果を評価することができます。

Protocol

>1. 生物発光による細胞生存率の測定

1. 細胞外マトリックス(ECM)混合物(Matrigelなど)でプレートをコーティングする:各ウェルに0.15 mg/mLのECM混合物40 μLを加え、プレートを37°Cで1時間インキュベートします。
2. 15,000、10,000、8,000、6,000、4,000、2,000、1,000、および500個のXG387-Luc細胞を含む100 μLの培地をコントロールとして、96ウェル光学ボトムプレートで各ウェルに6回繰り返し加え、細胞を37°Cで一晩培養します。
3. 上清を取り除き、150 ng/μL D-ルシフェリンを含む50 μLの培地を各ウェルに加え、細胞を37°Cで5分間インキュベートします。
4. IVISスペクトルイメージングシステムを使用して、プレート内の細胞バイオルミネッセンスの画像を取得します。内蔵ソフトウェアを使用して、関心領域(ROI)の複数の円形領域を作成し、細胞の生物発光を定量化します。

>2. テモゾロミド治療と併用スクリーニング

1. 処理の前に、ステップ1で説明したように4枚の96ウェルプレートをプレコートします。
2. 100 μL培地中の1,000細胞密度のXG387-Luc細胞を96ウェル光学ボトムプレートの各ウェルに播種し、細胞を一晩培養します。
3. テモゾロミドと標的薬剤をあらかじめストック溶液から調製します。800 μM、600 μM、400 μM、300 μM、200 μM、100 μM、および50 μMのテモゾロミドからなる濃度シリーズを単剤治療用の培地で調製します。テモゾロミドと標的薬剤を培地のストック溶液にそれぞれ希釈して、最終濃度を200 μMおよび2 μMに希釈し、併用薬剤のスクリーニングを行います(材料リスト)。
4. ほとんどのGSCがプレートの底部に付着している場合は、培地を取り出し、上記で調製したテモゾロミドを含む培地を各ウェルに加え、処理ごとに3回のテクニカルレプリケートを行います。
5. テモゾロミドを治療し、薬剤の組み合わせをスクリーニングするには、ブランク培地を取り外し、200 μM のテモゾロミドまたは 2 μM の標的薬剤、または両方の組み合わせを含む上記調製培地を各ウェルに加え、治療ごとに 3 回の技術的反復を行います。
6. すべてのプレートを37°C、5%CO₂で3日間インキュベートします。
7. 薬剤含有培地を取り出し、150 ng/μL D-ルシフェリンを含むブランク培地50 μLを各ウェルに加え、細胞を37°Cで5分間インキュベートします。
8. IVISスペクトルイメージングシステムを使用して、プレート内の細胞バイオルミネッセンスの画像を取得します。内蔵ソフトウェアを使用して、複数の環状ROIを作成し、細胞のバイオルミネッセンスを定量化します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	ギブコ	17504-044	50倍
EGFの	ギブコ	PHG0313	20 ng/ml
FGFの	ギブコ	PHG0263	20 ng/ml
グルタマックス	ギブコ	35050061	100倍
神経基礎	ギブコ	21103049	1倍
ペニシリン-ストレプトマイシン	ハイクローン	SV30010	P:10,000ユニット/ ml S:10,000 ug / ml
ピルビン酸ナトリウム	ギブコ	2088876	100 mM
ABT-737	MCEの		選択的およびBH3模倣Bcl-2 Bcl-xLおよびBclw阻害剤
アダボセルチブ(MK-1775)	MCEの		Wee1阻害剤
アキシチニブ	MCEの		マルチターゲットチロシンキナーゼ阻害剤
AZD5991	MCEの		Mcl-1阻害剤
Aの83から01	MCEの		TGF-β I型受容体ALK5キナーゼの強力な阻害剤
CGP57380	セレック		強力なMNK1阻害剤
ダクトリシブ(BEZ235)	セレック		デュアルATP競合PI3KおよびmTOR阻害剤
ダサチニブ	MCEの		デュアルBcr-AblおよびSrcファミリーチロシンキナーゼ阻害剤
エルロチニブ	MCEの		EGFRチロシンキナーゼ阻害剤
ゲフィチニブ	MCEの		EGFRチロシンキナーゼ阻害剤
リニファニブ	MCEの		VEGFRおよびPDGFRファミリーのマルチターゲット阻害剤
マシチニブ	MCEの		c-Kitの阻害剤
ML141	セレック		Cdc42 GTPaseの非競合阻害剤
OSI-930	MCEの		Kit、KDR、CSF-1Rのマルチターゲット阻害剤
パルボシクリブ	MCEの		選択的CDK4およびCDK6阻害剤
SB 202190 (英語	MCEの		選択的p38 MAPキナーゼ阻害剤
臭化セパントロニウム(YM-155)	MCEの		サバイビン阻害剤
TCS 359	セレック		強力なFLT3阻害剤
UMI-77	MCEの		選択的Mcl-1阻害剤
4-ヒドロキシタモキシフェン(アフィモキシフェン)	セレック		選択的エストロゲン受容体(ER)モジュレーター