SEC法によるミクログリア由来の細胞外小胞の単離:ミクログリア馴化培養培地から細胞外小胞を単離する技術

要約

出典:Lemaire, Q. et al.免疫細胞由来の細胞外小胞の特性評価と細胞環境への機能的影響の研究。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)に基づいて、脳の免疫細胞であるミクログリアに由来する細胞外小胞またはEVを分離する方法について説明しています。EVは、免疫応答を調節するメディエーターを送達する分子貨物として機能します。したがって、単離されたEVは、ニューロン免疫応答中のミクログリア-ニューロンクロストークを研究するためのin vitroモデルとして使用できます。

プロトコル

>1. ミクログリア/マクロファージの初代培養

1. ミクログリアの初代培養
   1. 10%エキソソームフリー血清、100 U/mLのペニシリン、100 μg/mLのストレプトマイシン、および9.0 g/Lグルコースを37°Cおよび5%CO₂で添加したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)で市販のラット初代ミクログリア(2 x 10⁶細胞)(材料表を参照)を培養します。
   2. 48時間の培養後に馴化培地を回収し、EVの単離に進みます。
2. マクロファージの初代培養
   1. 市販のラット初代マクロファージ(1 x 10⁶細胞)を、製造元が提供する培地(材料表を参照)で37°Cおよび5%CO₂で、エキソソームフリー血清と共に培養します。
   2. 24時間培養後に馴化培地を回収し、EVの単離に進みます。

>2. EVの分離

1. 空調媒体からのEVの事前絶縁
   1. ミクログリアまたはマクロファージの培養物(ステップ1.1.2または1.2.2)から錐形のチューブに馴染ませます。
   2. 1,200 x gで室温(RT)で10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
   3. 上清を新しい円錐形のチューブに移します。1,200 x gで室温で20分間遠心分離し、アポトーシス体を除去します。
   4. 上清を10.4mLのポリカーボネートチューブに移し、チューブを70.1Tiローターに移します。100,000 x gで4°Cで90分間超遠心分離し、EVをペレット化します。
   5. 上清を捨て、EVを含むペレットを0.20 μmろ過されたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)200 μLに再懸濁します。
2. EVのアイソレーション
   1. 自家製サイズ排除クロマトグラフィーカラム(SEC)の調製
      1. ガラス製クロマトグラフィーカラム(長さ:26 cm、直径:0.6 cm)(材料表参照)を空にし、洗浄して滅菌します。
      2. カラムの底に60μmのフィルターを置きます。
      3. 架橋されたアガロースゲルろ過ベースマトリックスとカラムを積み重ねて、直径0.6 cm、高さ20 cmの固定相を作成します。
      4. 50 mLの0.20 μmフィルターPBSで相をすすぎます。必要に応じて後で使用するために4°Cで保管してください。
   2. 再懸濁したEVペレットをSECカラムの固定相の上に置きます。
   3. 250 μL の連続フラクションを 20 個回収し、固定相の上部に 0.20 μm のフィルター付き PBS を引き続き追加して、カラムの乾燥を防ぎます。必要に応じて、フラクションを-20°Cで保存します.
      手記： 分子分析のためのEVの完全性を維持するために、-80°Cで1週間以上の長期保存を行うことができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ラットマクロファージ&ミクログリア培地	セルアプリケーション	R620K-100	細胞起源:正常な健康なラット 骨髄
ラット一次ミクログリア	ロンザ	RG535
セファロース CL-2B	GEヘルスケア	17014001
超遠心分離機	ベックマン・コールター	A95765 (英語)
超遠心分離機ローター 70.1 Ti	ベックマン・コールター	342184
グルコース	シグマ・アルドリッチ	G8769
リン酸緩衝生理食塩水	インビトゲン	14190094	カルシウム、マグネシウム不使用
ポリカーボネート製遠心チューブ	ベックマン・コールター	355651
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ	15140-122
エクソFBS	オザイム	EXO-FBS-50A-1	エクソソーム枯渇FBS
DMEMギブコ41966029
遠心機	エッペンドルフ	5804000010
CO2インキュベーター	サーモフィッシャー
pluriStrainer M/ 60 μm	プルリセレクト	43-50060
MonoP FPLC カラム	GEヘルスケア		もう利用できません

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