SDS-PAGEに基づく細胞外小胞関連タンパク質の抽出:EVからタンパク質を抽出し、それらをゲル内消化のために調製する手順

要約

出典: Lemaire, Q. et al. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (2020)

この動画では、細胞外小胞またはEVからのタンパク質抽出のためのSDS-PAGEゲル内消化法を実演します。単離されると、得られたタンパク質断片をプロテオミクス分析に使用できます。

プロトコル

1. EVの特性評価

1. ウェスタンブロット解析
   1. タンパク質抽出
      1. サイズ排除クロマトグラフィーカラム(SEC)でEVを単離し、ナノ粒子追跡分析(NTA)を使用して定量します。
      2. 50 μL の RIPA バッファー (150 mM 塩化ナトリウム [NaCl]、50 mM トリス、5 mM エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸 [EGTA]、2 mM エチレンジアミン-四酢酸 [EDTA]、100 mM フッ化ナトリウム [NaF]、10 mM ピロリン酸ナトリウム、1% ノニデット P-40、1 mM フェニルメタンスルホニルフッ化物 [PMSF]、1x プロテアーゼ阻害剤) を EV サンプル (フィルター上の EV 濃度から得られた 25 μL) と氷上で 5 分間混合して、タンパク質を抽出します。
      3. 氷上で5秒間(振幅:500 W、周波数:20 kHz)、3回超音波処理します。
      4. 水疱性破片を20,000 x gで10分間、4°Cで遠心分離して除去します。
      5. 上清を採取し、Bradfordタンパク質アッセイ法でタンパク質濃度を測定します。
   2. ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびウェスタンブロッティング
      1. タンパク質抽出物(30 μg)を5c Laemmliサンプルバッファー(v/v)と混合します。
      2. タンパク質ミックスを12%ポリアクリルアミドゲルにロードします。
      3. TGSバッファー(25 mM Tris pH 8.5、192 mM Glycine、0.1% SDS)を使用して、ゲル内のタンパク質を70 Vで15分間、120 Vで45分間移動させます。
      4. タンパク質をセミドライシステムのニトロセルロースメンブレンに230Vで30分間移します。
      5. ブロッキングバッファー(0.05% Tween 20 w/v、5% 粉乳 w/v 0.1 M PBS、pH 7.4)を用いて、室温でメンブレンを 1 時間飽和させます。
      6. メンブレンをマウスモノクローナル抗ヒト熱ショックタンパク質90(HSP90)抗体と4°Cで一晩インキュベートし、ブロッキングバッファー(1:100)で希釈します。
      7. メンブレンをPBS-Tween(PBS、0.05% Tween 20 w/v)で15分間3回洗浄します。
      8. ブロッキングバッファー(1:10,000)で希釈したヤギ西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG二次抗体とメンブレンをRTで1時間インキュベートします
         注:ネガティブコントロールは、二次抗体のみを使用して行われます。
      9. 洗浄手順を繰り返します(手順1.1.2.7)。
      10. 強化化学発光(ECL)ウェスタンブロッティング基質キットを使用してメンブレンを明らかにします(材料の表を参照)。

2. プロテオミクス解析

1. タンパク質抽出とゲル内消化
   1. サイズ排除クロマトグラフィーカラム(SEC)でEVを単離し、ナノ粒子追跡分析(NTA)を使用して定量します。EVタンパク質抽出について、ステップ1.1.1を繰り返します。
   2. 12%ポリアクリルアミドゲルのスタッキングゲル中でタンパク質の移動を行います。
   3. タンパク質をゲルにクマシーブルーで固定し、RTで20分間。
   4. 各色のゲル片を切除し、1 mm³の小片に切ります。
   5. 超純水で15分間、100%アセトニトリル(ACN)で15分間、100 mM重炭酸アンモニウム(NH₄HCO₃)で15分間、ACN:100 mM NH₄HCO₃(1:1、v / v)で15分間、100% ACNで5分間、各溶液300 μLでゲル片を連続的に洗浄します。
   6. 真空濃縮器で完全にゲル化したピースを乾燥させます。
   7. 10 mM ジチオスレイトールを含む100 mM NH₄HCO₃ 100 μLで、56°Cで1時間タンパク質還元を行います。
   8. 50 mMヨードアセトアミドを含む100 mM NH₄HCO₃ 100 μLで、室温で暗所で45分間タンパク質アルキル化を行います。
   9. 各溶液300 μLでゲル片を連続して洗浄します:100 mM の NH₄HCO₃ で 15 分間、ACN:20 mM NH₄HCO₃ (1:1、v/v) で 15 分間、100% ACN で 5 分間連続攪拌しながら
   。
   10. ゲル片を真空濃縮器で完全に乾燥させます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アセトニ トリル	フィッシャーケミカルズ	A955-1
重炭酸アンモニウム	シグマ・アルドリッチ	9830
HSP90 α/β 抗体 (RRID: AB_675659)	サンタクルス	SC-13119
バイオ・ラッド Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)	バイオ・ラッド	5000006
ジチオスレイトール	シグマ・アルドリッチ	43819
エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N、N、N'、N'-四酢酸	シグマ・アルドリッチ	03777から10G
エチレンジアミン四酢酸	シグマ・アルドリッチ	ED-100G
Fisherbrand Q500 Sonicator プローブ付き	フィッシャーブランド	12893543
イドアセトアミド	シグマ・アルドリッチ	I1149
インスタントブルー クマシー プロテインステイン	エクスペデオン	ISB1L(アイビー1L)
レムリ 2x	バイオ・ラッド	1610737
ノニデット P-40	フルーカ	56741
ペルオキシダーゼ AffiniPure ヤギ抗マウス IgG (H+L)	ジャクソン免疫研究	〒115-035-003
ファロイジン-テトラメチルローダミンコンジュゲート	サンタクルス	SC-362065
プロテアーゼ阻害剤	シグマ・アルドリッチ	S8830-20タブ
塩化ナトリウム	シャーラウ	SO0227
ドデシル硫酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	L3771
フッ化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S7920-100G
ピロリン酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S6422-100G
SpeedVac真空濃縮器	サーモフィッシャー
トランスブロットSDセミドライトランスファーセル	バイオ・ラッド	1703940