マウスモデルにおける頭蓋イメージングウィンドウの移植:マウス脳領域への安定した光学アクセスのためのガラスベースのカバースリップを埋め込む外科的処置

要約

出典:Alieva, M. et al. 侵襲的外科的生検に応答した脳腫瘍細胞の挙動の縦断的生体内イメージング。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、脳のさまざまな領域への安定した光学アクセスのために、マウスモデルに頭蓋窓を埋め込む外科的処置を紹介しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 腫瘍細胞移植と頭蓋イメージングウィンドウの準備

1. 手術準備
   1. 任意の系統または性別の成体マウス(>6週齢)を使用してください。マウスを鎮静剤として、フルアニゾン[神経遮断薬]+フェンタニル[オピオイド]（0.4mL/kg)+ベンゾジアゼピン鎮静剤(2mg/kg)を滅菌水に1:1:2の用量で注射します。つま先をつまんで動物の鎮静状態を評価します.
      手記：このプロトコルでは、これらの実験で使用された腫瘍細胞株 (GL261) の遺伝的背景が同じであるため、雌と雄の両方の C57BL/6 マウスが使用されました。マウスは1.5時間完全に鎮静されたままになります。あるいは、イソフルラン(1.5%〜2%イソフルラン/ O₂混合物)などの吸入麻酔を使用します。.
   2. マウスを定位フレームに取り付け、ノーズクランプと2つのイヤーバーを使用して頭を固定します。
   3. 体温を保つために、暖房ランプを使用してください。暖房ランプは注意して使用する必要があります。また、水循環式の加熱パッドを使用することもできます。
   4. マウスの角膜を乾燥から保護するために、眼軟膏を塗布します。
   5. 鋭利なハサミを使用して頭蓋骨(マウスの目から頭蓋骨の付け根までの背側領域)の毛皮を剃り、露出した皮膚を70%エタノールで消毒します。
   6. 鋭利なハサミで皮膚を円形に切り、綿棒で下の骨膜をこすり落とします。リドカイン1%+エピネフリン1:100,000を5分間一滴塗布し、綿棒で余分なものを取り除きます。
   7. 皮膚の端をシアノアクリレート接着剤で頭蓋骨に接着します。
   8. 定位フレームを4倍の倍率で解剖実体顕微鏡の下に置きます。
   9. 解剖顕微鏡で頭蓋骨を視覚化し、右頭頂骨に直径5mmの円形の溝を開けます。この手順は、頭蓋骨に圧力がかからないように、慎重に表面的にのみ実行します。
   10. 皮質緩衝液(125 mM NaCl、5 mM KCl、10 mMグルコース、10 mM HEPES緩衝液、2 mM MgSO₄、および2 mM CaCl₂ [pH 7.4])を一滴塗布し、細い鉗子を使用して骨フラップを持ち上げます。
   11. 次の手順では、特に指示がない限り、脳の表面を皮質バッファーで覆ったままにしてください。
   12. 解剖顕微鏡下で、脳表面を視覚化し、湾曲した先細りの非常に細かいポイントピンセットを使用して硬膜を取り除きます。この段階で出血が発生した場合は、吸収性ゼラチンスポンジを使用して出血を止めてください。

>2. 頭蓋イメージングウィンドウの準備

1. 皮質バッファーを取り外し、開頭部位にシリコンオイルを一滴垂らして、窓の下の気泡を防ぎます。
2. 露出した脳を6mmのカバースリップで密封します。カバーガラスと頭蓋骨の間にシアノアクリレート接着剤を塗布します。細かいピンセットを使用して、カバースリップを頭蓋骨にそっと押し付けて、脳とカバースリップの間の距離を最小限に抑えます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
25G x 16 mm皮下注射針	BDマイクロランス
吸収性ゼラチンスポンジ	ファイザー	300600
カバースリップ丸型6 mm	VWRインターナショナル		ゲルフォーム
シアノアクリレート接着剤	パテックス	〒631-0168	パテックスウルトラゲル
歯科用セメント	バーテックスデンタル		頂点自己硬化
ドリル	ドレメル		ドレメル3000(歯科用ドリルの方が便利かもしれません)+105彫刻カッター
細く湾曲したピンセット	デュモン
シリコーンオイル	シグマ・アルドリッチ	AGT508
脳定位固定装置用フレーム	ストールティング	181838
手術用ステレオ顕微鏡	オリンポス		ラボ標準定位固定装置、ラットおよびマウス
眼科用軟膏	ケラ・ベテリナリア		デュオドロップス ベター ケーラ 10 m
キシロカイン(リドカイン1%+エピネフリン1:100,000)局所麻酔薬	アストラゼネカ		キシロカイン(リドカイン1%+エピネフリン1:100,000)
ヒュノーマル	ベタファーマ株式会社		Hypnorm(クエン酸フェンタニル0.315 mg / mL +フルアニソン10 mg / mL)
ミダゾラム	アクタビス		ミダゾラムアクタビス5mg / mL