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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 生体内イメージング
>注:腫瘍細胞の注入と最初の生体内イメージングセッションとの間の時間間隔は、使用する腫瘍細胞株の種類によって異なります。このプロトコルで示された実験では、1x 105 GL261細胞を注入し、10日後にイメージングしました。
- イメージングの準備
- フェイスマスク(1.5%〜2%イソフルラン/ O2混合物)を介してイソフルラン吸入麻酔を使用してマウスを鎮静します。.
- マウスに100μLの生理食塩水バッファーを皮下注射して脱水症状を防ぎます
手記：長期イメージングのために、マウスは皮下注入ポンプを通じて水分補給することができます。
- マウスを上向きにしてイメージングボックスに入れます。直径1mmの穴が開いた金属板と開口部の周りに小さな磁石を埋め込んで、CIWをイメージングボックスに固定します。フェイスマスクを通してイソフルランを導入し、ボックスの反対側の出口(0.8%〜1.5%イソフルラン/ O2混合物)で換気します。.必要に応じて、テープを使用してマウスの本体を固定します。
手記：この時点で、血管の視覚化または他の染料のために蛍光標識されたデキストランを静脈内注射することができます。.
- オプションで、パルスオキシメータと加熱プローブを使用して、ムースのバイタルを監視します.
手記：この実験では、マウスはイメージング時間(2〜3時間)を通じて安定していたため、パルスオキシメータと加熱プローブを使用する必要はありませんでした。ただし、イメージング時間が長くなる場合は、より徹底的なモニタリングが必要になる場合があります。
- 25x(例:HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm)の水対物レンズを最も低いz位置に設定し、大きな水滴を追加します.
手記：水浸マイクロディスペンサーの使用は、科学者が実験中に水を追加できるため、長期実験に強くお勧めします。あるいは、ドライ対物レンズを使用することもできます。
- 37°Cに保たれた暗所チャンバーを備えた顕微鏡にイメージングボックスを移し、水滴が触れるまで対物レンズをCIWカバーガラスに持っていきます。
- 落射蛍光モードを使用して、接眼レンズを通して腫瘍を観察し、細胞に焦点を合わせます。
2. タイムラプス画像取得
- 画像化するいくつかの関心のある位置を選択し、それらの座標をソフトウェアに記録します。選択した位置が腫瘍の異なる部位を代表する位置であることを確認してください(各腫瘍は異なる場合がありますが、一貫性を確保するために、腫瘍のコアとすべてのマウスのエッジの中心にある同じ量の位置を選択します)
手記：腫瘍の一部または目に見える腫瘍全体のタイルスキャンを実施してもよい;ただし、腫瘍が大きい場合、この方法では画像間のタイムラプスが増加します。さらに、腫瘍細胞の動きが速い場合、同じ細胞を経時的に追跡するのが難しくなる可能性があります。
- 多光子モードに切り替えて、レーザーを正しい波長に調整します。光損傷を避けるためには、より高い波長が望まれることに注意してください.
手記：Dendra2イメージングには、960nmの波長を使用しました。これらの実験で使用された対物レンズでは、腫瘍核の良好な解像度を得て、腫瘍の代表的な領域をスキャンするには、1.3のズームで十分でした。
- ライブモードに進み、各位置のzスタックを定義することで、腫瘍細胞の解像度を損なうことなく、腫瘍細胞の最大量を得ることができます。画像間のステップ サイズを 3 μm と定義します。
- 双方向モードを使用して、スキャン速度を上げます。画像の解像度は 512 x 512 ピクセル以上である必要があります。
- 20分ごとに異なる位置で腫瘍体積の画像を取得し、2時間、各画像取得の前に対物レンズに水を追加します。
手記：タイムラプス画像は、ソフトウェアで適切なタイムラプスを設定することで自動的に取得できます。ただし、マウスは移動でき、位置またはzスタックは時間の経過とともに移動し、データが失われる可能性があります。したがって、タイムラプスを手動で実行し、取得間のxyzシフトを確認および調整することをお勧めします。
- このステップでは、オプションでDendra2蛍光マーカーをフォトスイッチします.
手記：タイムラプスイメージング(個々の腫瘍細胞の特性とそれらが時間の経過とともにどのように変化するかを研究できる)とは対照的に、これにより、脳内の腫瘍細胞浸潤領域を数日間にわたって研究することができます。