蛍光ベースのトランズウェルマクロファージ吸引アッセイ:化学誘起走性による腫瘍-マクロファージ相互作用を研究するためのIn Vitro法

要約

出典:An, Z. et al. 腫瘍とマクロファージの相互作用を研究するためのIn Vitroアッセイ。 J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオでは、蛍光ベースのトランスウェルマクロファージ相互作用アッセイを使用して、腫瘍とマクロファージの相互作用を研究しています。このアッセイには、化学的に誘発された走化性によるマクロファージの移動の解析が含まれます。

プロトコル

1. in vitroマクロファージ吸引アッセイ

1. コンディショニングメディアの調製

1. 腫瘍細胞維持培地を37°Cのウォーターバスで20分間温めます。
2. ティッシュカルチャーフード表面に70%エタノールをスプレーし、ペーパータオルで表面の70%エタノールを拭き取ります。冷蔵庫から細胞剥離液を取り出します。培地と細胞剥離液のボトルに70%エタノールをスプレーし、ペーパータオルで表面の70%エタノールを拭き取り、組織培養フードに持ち込みます。
3. 6ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。コンディショニングされた培地を慎重にピペットで15 mLの滅菌遠心チューブに入れます。チューブを氷の上に置きます。「培地のみ」の培地を別の15mL滅菌遠心分離チューブにピペットで入れます
   注:この手順の前に、顕微鏡で細胞が付着しているかどうかを確認してください。そうでない場合は、コーティングされたプレートを使用して、より良い取り付けを可能にするか、またはカウントステップにフローティングセルを含めることができます。
4. 0.5 mLの細胞剥離溶液を6ウェルプレートの各ウェルに加えます。腫瘍細胞が毎分切り上げられるかどうかを確認します。腫瘍細胞が丸まったら、プレートの側面を軽くたたいて細胞が剥離するのを助けます。
5. 腫瘍細胞維持培地2.5mLをウェルにピペットで移し、ピペットで3回上下に動かして細胞を混合し、15mLの滅菌遠心チューブに移します。10 μLの細胞を取り出し、10 μLのトリパンブルー溶液と混合します。混合物10μLを計数スライドにピペットで移し、自動セルカウンターを使用して生細胞の数を定量化します。
6. 無血清幹細胞培地を使用して、細胞数に応じてコンディショニング培地の容量を調整します(37°Cで一晩インキュベート)。例えば、ウェルAの生細胞数がウェルの3倍で細胞数が少ない場合は、そのコンディショニング培地を1:3に希釈します。このステップは、細胞増殖速度によって引き起こされる差を制御するために使用されます.
   手記： 無血清幹細胞培地を37°Cで一晩インキュベートする理由は、37°Cの長時間の曝露で培地に起こりうる変化を制御するためです。
7. 0.45 μmフィルターでコンディショニングされた媒体をろ過します。コンディショニングされたメディアを氷の上に置きます.
   注:この手順では、コンディショニング培地中の細胞と細胞の破片を除去します。

2. MV-4-11細胞の調製

1. IMDM培地(FBSなし)を37°Cのウォーターバスで20分間温めます。
2. ティッシュカルチャーフード表面に70%エタノールをスプレーし、ペーパータオルで表面の70%エタノールを拭き取ります。中型ボトルに70%エタノールをスプレーし、ペーパータオルで表面の70%エタノールを拭き取り、ティッシュカルチャーフードに持ち込みます。
3. MV-4-11細胞のフラスコを組織培養フードに取り込む。10 mLの細胞を15 mLの滅菌遠心チューブにピペットで移します。10 μLの細胞を取って、10 μLのトリパンブルー溶液と混合します。混合物10μLを計数スライドにピペットで移し、自動セルカウンターを使用して生細胞の数を定量化します。細胞を200 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引します。
4. 細胞を10mLのPBSで洗浄し、細胞を200 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
5. 細胞をIMDM培地(FBSなし)に再懸濁して、最終細胞密度が1x10⁶細胞/mL><になるようにします。 注:ここで使用するマクロファージの細胞数は調整できます。

3. トランズウェルアッセイ

>注:このステップでは、細胞遊走アッセイキットを使用するか、試薬を購入して別途挿入してください。MV-4-11細胞の場合は、ポアサイズが5 μmのTranswellインサートを選択します。マクロファージの遊走を検出するには、下部チャンバー内のマクロファージの数を直接定量するか、比色/蛍光法を使用します。ここでは、比色法を用いたアッセイのデモを行います。

1. 24ウェルプレート、インサート、試薬を室温に戻します。
2. 上記で調製したMV-4-11細胞250 μLを各インサートに加えます。
3. 400 μLのコンディショニング培地/培地のみ(37°Cで一晩インキュベートすると、これらのサンプルがネガティブコントロールとして機能します)を24ウェルプレートの下部チャンバーに加えます。腫瘍ラインまたはコントロールごとに、トリプリケートサンプルを使用します。インサートとコンディショニングされた媒体の間に気泡が入らないようにしてください。バブルは、マクロファージがボトムウェルに移動するのを阻害します。
4. プレートを37°Cインキュベーターで5%_CO2と4時間インキュベートします
   注:インキュベーション時間は調整できます。下部チャンバーに移動する細胞は、顕微鏡で見ることができます。
5. 同じウェルの内壁にあるインサートを軽くたたいて、インサートを廃棄します。MV-4-11細胞は懸濁液中で増殖するため、ここでは細胞剥離液やトリプシン処理は必要ありません。
6. ウェル内の細胞を3回上下に静かにピペットで動かして混合します。225 μLの細胞懸濁液を、蛍光測定に適した黒壁の96ウェルプレートに移します。
7. CyQuant色素を4倍溶解バッファーで1:75に希釈します。一時的にボルテックスし、溶液をスピンダウンします。96ウェルプレートの各ウェルに75 μLの溶液を加えます。室温で15分間インキュベートします。
8. 480/520 nmフィルターセットと蛍光プレートリーダーを使用して蛍光を読み取ります。
9. ブランクを差し引き、コントロール腫瘍細胞株に正規化してデータを分析します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 mLセロロジカルピペット	オリンパスのプラスチック	12〜104
15 mL滅菌遠心チューブ	オリンパスのプラスチック	28から103
1 mLピペットチップ	ART分子バイオプロダクツ	2779-RIの
2 mL吸引ピペット	隼	357558
24ウェルプレート	ミリポア	ECM507	ECM507の一部、または 別途購入
4倍溶解バッファー	ミリポア	ECM507	ECM507の一部、または 別途購入
5 μm トランズウェルインサート	ミリポア	ECM507	ECM507の一部、または 別途購入
アキュターゼ	革新的な細胞技術	AT-104
B27	ギブコ	12587-010
CyQuant 染料	ミリポア	ECM507	ECM507の一部、または 別途購入
DMEM	ギブコ	11965-092
DMEM:F12	ギブコ	〒10565-018
EGFの	ペプロテック	AF-100-15
FBSの	ギブコ	26140
FGFの	ペプロテック	100-18B
IMDM	ギブコ	12440-053
PBSの	ギブコ	14190-144
ペン連鎖球菌	ギブコ	15140-122
トリパンブルー	バイオラッド	1450021

さん の の