細胞外小胞抽出:示差遠心分離法を用いて全組織標本から細胞外小胞を単離する技術

要約

出典:Hurwitz, S. N. et al.全組織からの細胞外小胞の抽出。J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオでは、新鮮または凍結した組織から細胞外小胞を抽出する技術について説明しています。単離された細胞外小胞は、疾患の病因における重要な役割を明らかにするためのさらなる分析に使用できます。

プロトコル

1. 組織解離と分画遠心分離

1. 10 mLの解離バッファー(10 mgのパパイン、5.5 mM L-システイン、67 μM 2-メルカプトエタノール、1.1 mM EDTA)をHibernate-E培地で約0.4〜1.0 gの組織に調製します><。 注:EVの濃縮および精製に使用されるすべての溶液は、超純ろ過水で希釈する必要があります。
2. 新鮮組織または凍結組織全体を50 mLコニカルチューブ内の解離バッファーに加え、37°Cの温水浴で20分間インキュベー
トします。
3. インキュベーション後、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を添加して、組織を含む解離バッファーに最終1倍の濃度にします。
4. 組織を含む溶液をルーズフィットのDounceホモジナイザーに注ぎ、サンプルあたり約30回のスローストロークを使用して組織を穏やかに解離します。ストロークの数は、組織の一貫性に基づいて調整できます。
5. 緩衝液中の解離した組織を50 mLのコニカルチューブに移し、500 x gで4°Cで5分間遠心分離して、細胞と残りの繊維状または凝集性の組織断片をペレット
化します。
6. 上清を清潔な50 mLコニカルチューブに移し、2,000 x gで4°Cで10分間遠心分離して、大きな細胞破片をペレット化して廃棄します。
7. 上清を再びきれいな50 mLコニカルチューブに移し、10,000 x gで40分間、4°Cで遠心分離して、望ましくない大きな小胞または小さなアポトーシス体をペレット化します
   注:このペレットは、必要に応じて、より大きな小胞の追加研究のために保存できます。
8. 上清を0.45 μmフィルターで清い12 mLの超遠心チューブにデカントします
   手記： 緻密な線維性組織サンプルは、容易にろ過できない場合があります。これらのサンプルは、40 μmのセルストレーナでろ過し、次に小さな針(18 G、20 G、22 G)を連続して通過させてから、0.45 μmのフィルターでろ過できます。
9. サンプルを100,000 x gで4°Cで2時間超遠心分離し、小型EVをペレット化します。
10. 上清をデカントし、超遠心チューブを5〜10分間逆さまにし、頻繁に軽くたたいてチューブの側面に残っている液体を取り除きます。残留液は、吸引真空ピペットを使用して吸引することもできます。
11. 1.5 mLの0.25 Mショ糖緩衝液(10 mM Tris、pH 7.4)にEVペレットを再懸濁します。このステップでは、ペレットが完全に再懸濁するようにすることが重要です。これを行うには、EVを溶液にボルテックスする前に、チューブをパラフィルムで覆います。超遠心チューブを室温で15〜20分間揺さぶってから、最終的なボルテックスミックスを行います。
12. チューブを1,000 x g以下の速度で短時間遠心分離し、チューブの底にある液体懸濁液を回収します。
13. 以下のグラジエント精製手順に進むか、必要に応じてEV懸濁液を4°Cで一晩保存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.45μmフィルター	VWRの	28145-505
12 mL超遠心チューブ	ベックマン・コールター	331372
5.5 mL 超遠心チューブ	ベックマン・コールター	344057
HALTホスファターゼ阻害剤(100倍溶液)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	78420
HALTプロテアーゼ阻害剤(100倍溶液)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	78438
ハイバネイトEミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1247601
MLS-50 スイングバケットローター	ベックマン・コールター	367280
Optima MAX-XP 卓上型超遠心分離機	ベックマン・コールター	393315