方法論記事

細胞外小胞の亜集団の精製:密度勾配超遠心分離法を用いた細胞外小胞の亜集団の精製技術

2023年4月30日

この記事について

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出典: Urwitz, S. N. et al. Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue. J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオは、特性評価研究に適した細胞外小胞の亜集団を分離するための密度勾配超遠心分離ベースの精製方法を示しています。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 密度勾配の精製

  1. 1.5 mLの60%ヨージキサノール(水溶液)を1.5 mLのショ糖/トリス緩衝液にEVを添加して、30%ヨージキサノールを含有する最終溶液を調製します。ピペットを数回上下させて溶液を完全に混合します.
    手記： ピペットチップ内の溶液が失われないように注意してください、高ヨウジオキサノール濃度は非常に粘性が高いからです。
  2. EVを含む30%ヨージキサノール緩衝液を5.5 mL超遠心チューブの底に移します。
  3. 60% iodixanol ストック溶液の超純水に、サンプルあたり少なくとも 1.5 mL の 20% および 10% iodixanol 溶液を調製します。
  4. 1.3mLの20%ヨージキサノールを測定し、シリンジと18G針を使用して下部の勾配層の上に慎重に重ねます。密度界面での層の混合を避けるために、針のベベルを半月板のすぐ上の超遠心チューブの内側に接触させ、溶液を滴下します。
  5. 上記と同じ手法を使用して、20%ヨージキサノール層の上に10%ヨージキサノール溶液1.2mLを層状にします。.
  6. 超遠心チューブを慎重にバランスを取り、ローターバケットにロードし、スイングバケットローターで268,000 x g、4°Cで50分間遠心分離します。遠心分離機の加速速度と減速速度を最小速度に設定して、密度層の破壊を回避します。
  7. 各サンプルについて、10本の1.5 mL微量遠心チューブを、密度勾配のフラクション1から10に対応するように標識します。分数 1 は最初に削除される最上位の分数として指定され、分数 10 は最後に削除される最下位の分数として指定されます。
  8. グラジエント超遠心分離が完了したら、ローターバケットからチューブをそっと取り外し、安定したホルダーに入れます。目に見える小胞の帯は、多くの場合、関心のある部分に見られます。グラジエントの上部から490μLのシリアルフラクション10個を対応するチューブにピペットで移します。チューブの底には、汚染タンパク質が含まれている可能性のある少量の液体が残っています。このサンプルは、必要に応じて、フラクション11として廃棄または保持することができます。
  9. 屈折計を使用して分画の屈折率を測定します。これは、サンプルの保存が必要な場合に、制御グラジエントを並行して実行して実行することもできます。イオジキサノールを含む各画分を20〜30 μLの屈折計表面にピペットで移し、屈折率を既知のイオジキサノール密度と比較して密度を推定します
    手記：フラクションは、必要に応じて、次の超遠心分離洗浄ステップに進む前に、ヨージキサノール含有溶液で一晩保存できます。
  10. 各フラクションを清潔な12 mL超遠心チューブに移します。5 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS;137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4、pH 7.4)をチューブに加え、ゆっくりと上下にピペッティングして混合します
    注:サンプルに添加するPBSは、0.22μmフィルターで滅菌PBSをろ過し、塩分沈殿を避けるために室温で保存することにより、粒子を含まないものでなければなりません。
  11. さらに6mLの1x PBSを上部に加え、再度慎重に混合します。
  12. チューブを100,000 x gで4°Cで2時間超遠心分離し、小さな小胞を再ペレット化します。タンパク質分析のための小胞の溶解または形態学的分析のためのEVの再懸濁の前に、上清をデカントし、チューブを軽くたたいて乾かします。

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.45μmフィルターVWRの28145-505
12 mL超遠心チューブベックマン・コールター331372
5.5 mL 超遠心チューブベックマン・コールター344057
FA-45-6-30ローター エッペンドルフ5820715006
MLS-50 スイングバケットローターベックマン・コールター367280
Optima MAX-XP 卓上型超遠心分離機 ベックマン・コールター393315
Optima XE-100 超遠心分離機ベックマン・コールターA94516 の
オプティプレップシグマD1556滅菌水溶液中の60%イオジキサノール
レフラクト30PX(屈折計)メトラー・トレド51324650
S-4-104 ローターエッペンドルフ5820759003
SW 41 Ti スイングバケットローターベックマン・コールター333790
卓上型5804R遠心分離機エッペンドルフ22623508

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タグ

EV Tris PBS

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