末梢血単核細胞(PBMNC)からの誘導神経幹細胞(iNSC)の生成:仙台ウイルスを用いたPBMNCsのiNSCへの再プログラム法

要約

出典:Zheng, W. et al. 末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究のためのドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化。J. Vis. Exp. (2019年度)

このビデオは、センダイウイルスを使用して末梢血単核細胞(PBMNC)を誘導神経幹細胞(iNSC)に再プログラミングする方法を示しています。センダイウイルスは、細胞を再プログラミングするための効率的で安全な手段を提供する非統合ウイルスです。

プロトコル

>1. SeV感染によるPBMNCsのiNSCsへのリプログラミング

1. 溶液と培地の調製
   1. 100 mgのPDLを100 mLのH₂Oとともに1 mg/mLの濃度に溶解することにより、ポリ-D-リジン(PDL)原液を調製します。-20°Cで1mLのアリコートで保存してください。
   2. 100 mgのインスリンを20 mLの0.01 N HClに5 mg / mLの濃度に溶解して、インスリンストック溶液を調製します。.-20°Cで1mLのアリコートで保存してください。
   3. 200 mLのiNSC基礎培地を調製するには、96 mLのDMEM-F12と96 mLの塩基性培地(材料表)を、2 mLの100倍グルタミンストック溶液、2 mLの非必須アミノ酸(NEAA)、2 mLのN2サプリメント、および2 mLのB27サプリメントと組み合わせます。使用前に、10 ng/mLの組換えヒト白血病阻害因子、3 μM CHIR99021、2 μM SB431542を添加します。培地をろ過し、4°C.
      で保存します。 手記：2週間以内に媒体を使用してください。組換えヒト白血病抑制因子を添加し、使用直前にCHIR99021およびSB431542してください。
2. SeV感染によるPBMNCsのiNSCsへのリプログラミング
   1. 使用前にクリーンベンチを紫外線滅菌してください。すべての表面と機器を75%アルコールで滅菌します。オートクレーブを使用してすべてのチップを滅菌します。
   2. 0日目に、MNC培地で細胞を採取し、15mLのコニカルチューブに移します。細胞を200 x gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、予熱したMNC培地1 mLで細胞を再懸濁します。
   3. トリパンブルーで生存細胞を数えます。予め加温した(37°C)MNC培地で細胞を2 x 10⁵細胞/ウェルの濃度まで24ウェルプレートに再懸濁します。
   4. -80°Cで保存したSeVチューブを取り出した後、SeVを含むチューブを37°Cのウォーターバスで5〜10秒間解凍し、RTで解凍します。解凍したら、すぐに氷の上に置きます。
   5. ヒトKlf4、Oct3/4、SOX2、およびc-MyCをコードするSeVを、感染の多重度(MOI)10でウェルに加えます。1,000 x gのプレートで細胞を30分間遠心分離し、細胞の接着を促進します。細胞と上清をプレートに残します。プレートをインキュベーターに37°C、5%CO₂.
      に置きます 注意: SeVを含むすべての手順は安全キャビネットで実行する必要があり、すべてのチップとチューブは廃棄する前にエタノールまたは漂白剤で処理する必要があります。
   6. 1日目に、培地と細胞を15 mLの遠心チューブに移します。1 mLのMNC培地でウェルをすすぎます。細胞懸濁液を200 x gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、24ウェルプレート中の500 μLの新鮮な温めたMNC培地で細胞を再懸濁します
      手記：PDL/ラミニンにめっきする前に、細胞の付着を防ぐために、低付着の24ウェルプレートを使用してください。
   7. 2日目に、1 mLの1 mg / mL PDLを19 mLのD-PBSで50 μg / mLの濃度に希釈します。.6ウェルプレートを50 μg/mL PDLでRTで少なくとも2時間コーティングします。
   8. 0.5 mg/mL ラミニン 200 mL を D-PBS 20 mL で 5 μg/mL に希釈します。6ウェルプレートでPDLを吸引し、垂直クリーンベンチで乾燥させます。
   9. 6ウェルプレートに5 μg/mLラミニンをコーティングし、37°Cで4〜6時間インキュベートし、使用前にD-PBSで洗浄してください。
   10. 3日目に、ステップ1.2.6で得られた形質導入細胞をiNSC培地でPDL/ラミニン被覆6ウェルプレートにプレート化します。
       手記：細胞をPDL/ラミニンコーティングプレートに置いた後、細胞の付着を妨げないように、必要に応じてプレートを静かに動かします。
   11. 5日目に、予熱した1 mLの温めた(37°C)iNSC培地を6ウェルプレートの各ウェルに穏やかに加えます。
       手記：細胞は劇的な死(>60%)を経験することが予想されます。
   12. 7日目に、予熱した1 mLの温めた(37°C)iNSC培地を6ウェルプレートの各ウェルに穏やかに加えます。
   13. 9日目から28日目まで、使用済みの培地を新鮮な温めた(37°C)iNSC培地に毎日交換してください。iNSCコロニーの出現を監視します。約2〜3週間で拡張するiNSCクローンを選択して転送します。燃焼させたガラスピペットを使用して、汚染の可能性のある細胞を排除し、適切な形態のコロニーをピックアップし、200 μLチップでコロニーを吸引します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
B27サプリメント	インビトゲン	17504044
CHIR99021	遺伝子操作	04-0004
DMEM-F12	ギブコ	11330
DMEM-F12	ギブコ	11320
ラミニン	ロシュ	11243217001
N2サプリメント	インビトゲン	17502048
NEAAの	インビトゲン	11140050	非必須アミノ酸
神経基礎	ギブコ	10888	ベーシックメディウム
PDLの	シグマ・アルドリッチ	P7280	ポリ-D-リジン
SB431542	遺伝子操作	04-0010-10mg	-20で光から保管しますか?
仙台ウイルス	ライフテクノロジー	MAN0009378
インスリン	ロシュ	12585014
24ウェルプレート	コーニング	3337
15mlコニカルチューブ	コーニング	430052
6ウェルプレート	コーニング	3516
エポ	ペプロテック	100〜64〜50UG	ヒトエリスロポエチン
ヒト白血病阻害因子	ミルポア	LIF1010
ヒト組換えSCF	ペプロテック	300-07-100UG
IGF-1	ペプロテック	100〜11〜100UG	ヒトインスリン様成長因子
IL-3	ペプロテック	200-03-10UGの	ヒトインターロイキン3
デキサメタゾン	シグマ・アルドリッチ	D2915-100MG
IMDM	ギブコ	215056から023	イスコーブの修正ダルベッコの媒体
インスリン	ロシュ	12585014
ITS-Xの	インビトゲン	51500-056	インスリン-トランスフェリン-セレン-Xサプリメント
グルタマックス	インビトゲン	21051024	グルタミン原液100×
ハムのF12	ギブコ	11765-054
1-チオグリセロール	シグマ・アルドリッチ	M6145	吸入や皮膚接触に対して有毒
アスコルビン酸	シグマ・アルドリッチ	A92902の	皮膚に触れると有毒です
ノックアウト血清の補充	ギブコ	10828028	無血清基礎培地
既知組成の脂質濃縮物	インビトゲン	11905031
トランスフェリン	R&Dシステム	2914-HT-100グラム
トリパンブルー	ギブコ	T10282

型 名 名 の の です