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人間の参加者が関与するすべての手順は、人間の福祉に関する制度的、国内的、および国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。
1. 血漿1mLからの循環cfDNAの精製
注意: この手順は、市販のキットを使用して実行します(資料の表を参照)。すべてのバッファーはキットに付属しています。
- バッファーと試薬の調製
注意： 酸性溶液や漂白剤をサンプル調製廃棄物に直接添加しないでください。Lysis Buffer、Binding buffer、および Wash Buffer-1 に含まれるグアニジン塩は、漂白剤または酸と組み合わせると、反応性の高い化合物を生成することができます。
- 結合バッファー:300 mLの結合バッファー濃縮物と200 mLの100%イソプロパノールを混合して、500 mLのワーキング結合バッファーを調製します。室温で保存.
手記：結合バッファーは、循環する核酸をシリカ膜に最適に結合することを可能にします。500mLの結合緩衝液は、それぞれ1、2、3、4、または5mLの血漿の276、138、92、69または55のサンプルを処理するのに十分であり、室温で1年間安定です。
- Wash Buffer-1:19 mLのWash Buffer-1濃縮物を25 mLの96–100%エタノールと混合して、44 mLのWash Buffer-1を調製します。室温で保存.
手記：Wash Buffer-1は、シリカ膜に結合した汚染物質を除去します。44 mLのWash Buffer-1は、1/2/3/4/5 mLの血漿73サンプルを処理するのに十分であり、室温で1年間安定です。
- Wash Buffer-2:13 mLのWash Buffer-2濃縮液を30 mLの96–100%エタノールとよく混合して、43 mLのWash Buffer-2を調製します。室温で保存.
手記： Wash Buffer-2は、シリカ膜に結合した汚染物質を除去します。43 mLのWash Buffer-2は、1/2/3/4/5 mLの血漿を~56サンプル処理するのに十分で、室温で1年間安定です。
- 凍結乾燥キャリアRNA310 μgのチューブに、溶出バッファー1,550 μLを加え、0.2 μg/μLのキャリアRNA溶液を調製します。キャリアRNAを完全に溶解した後、溶液を適切なアリコートに分割し、-30°C〜-15°Cで保存します。これらのアリコートを3回以上凍結融解しないでください。 表1に示すように、溶解バッファーに溶解した再構成キャリアRNAを添加します
手記：キャリアRNAはLysisバッファーに直接溶解しないため、まずElutionバッファーに溶解し、次にLysisバッファーに溶解する必要があります。まず、シリカ膜-核酸の結合は、サンプル中に存在する標的分子が非常に少ない場合に増強されます。第二に、大量のキャリアRNAが存在するため、RNA分解のリスクが軽減されます。
- 単離を開始する前に、カラムとサンプルを室温に戻して、必要に応じて滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用してサンプル量を1 mLに調整します。50 mLの遠心分離チューブと2 mLの収集チューブを含む2つのウォーターバスまたは加熱ブロックを、それぞれ60°Cと56°Cに予熱します。
- 50 mLの遠心チューブに、100 μLのProteinase K、1 mLの血漿、および1.0 μgのキャリアRNAを含む0.8 mLのLysisバッファー(ステップ1.1.4で調製)を加えます。遠心分離管をキャップで閉じ、チューブ内の渦が見えるようにしながら、30秒間パルスボルテックスで内容物を混合します。内容物の徹底的な混合は、効率的な溶解のために重要です.
手記：ボルテックス後すぐに、遅滞なくステップ1.4に進みます。
- 溶液を60°Cで30分間インキュベートします。
- キャップを取り外し、1.8 mLの結合バッファーをチューブに加え、キャップを装着した後、パルスボルテックスで15〜30秒間完全に混合します。
- 得られた混合物を氷上で5分間インキュベートし、シリカ膜カラムを真空ポンプに接続されている真空装置に挿入します。次に、サンプルの漏れを防ぐために、20 mLチューブエクステンダーをオープンカラムにしっかりと挿入します。
- インキュベートした混合物をカラムのチューブエクステンダーに慎重に注ぎ、真空ポンプのスイッチを入れます。すべてのライセート混合物がカラムを完全に通過した後、真空ポンプのスイッチを切り、圧力を0 mbarに解放し、チューブエクステンダーを取り外して廃棄します
手記： クロスコンタミネーションを避けるために、チューブエクステンダーは、隣接するカラムに広がるのを防ぐために、慎重に廃棄する必要があります。
- カラムを真空装置から取り出し、収集チューブに挿入し、室温で11,000 x gで30秒間遠心分離し、残留ライセートを除去します。フロースルーを破棄します。
- 600 μL の Wash Buffer-1 をカラムに加え、11,000 x g で室温で 1 分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
- 750 μL の Wash Buffer-2 をカラムに加え、11,000 x g で室温で 1 分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
- 750 μL のエタノール (96–100%) をカラムに加え、11,000 x g で室温で 1 分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
- カラムを 20,000 x g で 3 分間遠心分離し、清潔な 2 mL の収集チューブに入れます。
- メンブレンカラムアセンブリを新しい2 mLコレクションチューブに入れ、蓋を開けた状態で56°Cで10分間インキュベートして、メンブレンカラムアセンブリを完全に乾燥させます。
- カラムを清潔な1.5 mL溶出チューブに入れます。カラムメンブレンの中央に20〜150 μLの溶出バッファーを塗布し、蓋を閉めた状態で室温で3分間インキュベートします><。
手記：溶出バッファーが室温まで平衡化していることを確認します。50 μL未満の溶出バッファーを使用する場合は、メンブレンの中央に慎重に分注してください。これにより、結合したDNAが完全に溶出されます。ただし、溶出量は固定されておらず、ダウンストリームアプリケーションに応じて変更できます。回収された溶出液は最大 5 μL で、カラムに適用される溶出量よりも確実に少なくなります。
- 回収した溶出液を20,000 x gの微量遠心分離機で1分間遠心分離し、核酸を溶出し、-20°Cで保存します。
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| サンプル番号 | 溶解バッファー(mL) | 溶出バッファー中のキャリアRNA (μL) |
| 1 | 0.9 | 5.6 |
| 2 | 1.8 | 11.3 |
| 3 | 2.6 | 16.9 |
| 4 | 3.5 | 22.5 |
| 5 | 4.4 | 28.1 |
| 6 | 5.3 | 33.8 |
| 7 | 6.2 | 39.4 |
| 8 | 7 | 45 |
| 9 | 7.9 | 50.6 |
| 10 | 8.8 | 56.3 |
| 11 | 9.7 | 61.9 |
| 12 | 10.6 | 67.5 |
| 13 | 11.4 | 73.1 |
| 14 | 12.3 | 78.8 |
| 15 | 13.2 | 84.4 |
| 16 | 14.1 | 90 |
| 17 | 15 | 95.6 |
| 18 | 15.8 | 101.3 |
| 19 | 16.7 | 106.9 |
| 20 | 17.6 | 112.5 |
| 21 | 18.5 | 118.1 |
| 22 | 19.4 | 123.8 |
| 23 | 20.2 | 129.4 |
| 24 | 21.1 | 135 |
テーブル 1.1 mL の血漿サンプルの処理に必要な Lysis バッファーおよびキャリア RNA(Elution バッファーに溶解)の量。