自動キャピラリー電気泳動に基づくcfDNAのフラグメントサイズ分布解析:DNAマイクロチップを用いた生体液から単離されたDNAフラグメントのサイズ分布の研究法

要約

出典: Palande, V. et al. がん患者の血漿サンプル中の無細胞DNAの検出。 (2020年)

この動画では、全自動キャピラリー電気泳動を用いて、無細胞DNAまたはcfDNA断片のサイズ分布を解析しています。この手法は、アポトーシス中にがん細胞によって放出されるDNA断片のプロファイルに関する洞察を得るのに役立ちます。

プロトコル

1. Fragment AnalyzerによるcfDNAのDNA断片サイズ分布

1. 手順を開始する前のステップ:DNA色素濃縮物とDNAゲルマトリックスを室温で30分間平衡化します。
2. ゲル染料ミックスの調製
   手記：DMSOは組織への有機分子の侵入を促進することが知られているため、溶液の取り扱いには注意してください。
   1. DNA色素濃縮バイアルを10秒間ボルテックスしてDMSOを完全に解凍し、この濃縮液15μLをDNAゲルマトリックスバイアルにピペットで取り出し、暗所で4°Cで保存します。
   2. 再度、キャップされたバイアルを10秒間ボルテックスして、ゲルと色素の混合が視覚化されるまでします。
   3. スピンフィルターでミックスを上部のレセプタクルに注ぎます。
   4. スピンフィルターを2,240 x g±20%で室温で10分間微量遠心分離します。
   5. 準備したゲル染料をチューブにラベル付けし、実験室の優れた慣行に従ってフィルターを廃棄します。チューブにラベルを貼り、準備日を記録します.
      手記：濾液は、優れた実験室の慣行に従って廃棄します。ゲル色素ミックスは、5つの高感度(HS)DNAチップに使用できます。1時間以上使用しない場合は、4°Cで保存し、暗所での保存は最大6週間可能です。
3. ゲル染料ミックスをロードするには、チッププライミングステーションのベースプレートの位置を確認し、クリップを最も低い位置に調整します。
   1. ゲル色素混合物を室温で30分間平衡化し、光への曝露を監視します。
   2. 密封された袋から新しいHS DNAチップを取り出し、チッププライミングステーションに置き、9.0 μLのゲル染料混合物を取り出し、チップウェルの底に「G」とマークして分注します
      手記：バイアルの底に蓄積する可能性のある粒子を避けて、ゲル染料ミックスを引き上げます。ゲル色素ミックスをHS DNAチップウェルに分注しながら、大きな気泡の形成を防ぐために、ピペットの先端を完全に挿入します。さらに、ウェルの端でピペットに触れると、結果が悪くなります。
   3. プランジャーを1 mLに置き、チッププライミングステーションを閉じます。ラッチのロックがカチッと音を立てることを確認し、タイマーを60秒に設定してから、プランジャーがクリップに保持されるまで押し下げ、正確に60秒後にクリップリリースメカニズムでプランジャーを解放します。
   4. プランジャーが少なくとも 0.3 mL のマークまで後退したら、5 秒待ってからゆっくりと 1 mL の位置まで引き戻し、チッププライミングステーションを開き、9.0 μL のゲル色素混合物を再度取り出し、「G」とマークされた HS DNA チップウェルの底に分注します。
4. DNAマーカーをロードするには、はしご記号でマークされたウェルに5μLのDNAマーカーを分注します。11個のサンプルウェルすべてについてこの手順を繰り返します。
5. ラダーとサンプルをロードするには、ラダー記号でマークされたウェル内のDNAラダー1μLを分注し、11個のサンプルウェルすべてに1μLのサンプル(使用済みウェル)または1μLのマーカー(未使用のウェル)を追加します。
6. HS DNAチップをアダプターに水平に置き、2,400rpmで60秒間ボルテックスします。HS DNAチップを固定するバルジがボルテックス中に損傷していないことを確認してください。
7. HS DNAチップをフラグメントアナライザー装置に挿入するには、蓋を開けて電極カートリッジが正しく挿入されていること、およびチップセレクターがフラグメントアナライザー装置の「dsHigh Sensitivity DNA」に配置されていることを確認します。
8. HS DNAチップを一方向のみに収まるレセプタクルに慎重に取り付け、電極カートリッジがHS DNAチップのウェルに正確に収まるようにして蓋を閉めます。
9. フラグメントアナライザーソフトウェア画面のディスプレイは、画面左上のチップアイコンを通じて、挿入されたHS DNAチップと閉じた蓋を示します。
10. HS DNAチップランを開始するには、装置画面の「Assay」メニューからdsDNA High Sensitivity Assayを選択し、サンプル名やコメントなどの情報を入力してサンプル名のテーブルを適切に埋め、画面右上の「Start」ボタンをクリックしてチップランを開始します。
11. HS DNAチップ実行後の電極洗浄:アッセイが完了したらすぐに使用済みのHS DNAチップを取り外し、優れたラボの慣行に従って廃棄してください。以下の手順を実行して、電極がクリーンで、前のアッセイからの残留物がないことを確認します。
    1. 350 μLの脱イオン分析グレードの水を電極クリーナーウェルの1つにゆっくりと充填し、蓋を開けて電極クリーナーをフラグメントアナライザー装置に入れ、蓋を閉めて約10秒待ちます。
    2. 蓋を開けて電極クリーナーを取り外し、電極の水が蒸発するまでさらに10秒待ってから蓋を閉めます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2100バイオアナライザー機器	アジレント・テクノロジーズ(株)	G2939BA	2100 Bioanalyzerシステムは、生体分子のサンプル品質管理のための確立された自動電気泳動ツールです。
プライミングステーション用の調整可能なクリップ	アジレント・テクノロジーズ(株)	〒5042-1398	シリンジと組み合わせて使用 し、チッププライミングのために定義された圧力を適用します。
cf-DNA/cf-RNA防腐チューブ	ノルゲンビオテック株式会社	63950	Norgenのcf-DNA/cf-RNA防腐剤チューブは、ヒト全血サンプル中のcf-DNA、循環腫瘍DNA、cf-RNA、循環腫瘍細胞の収集と保存のために、密閉された真空プラスチックチューブです
チッププライミングステーション	アジレント・テクノロジーズ(株)	〒5065-4401	各アッセイキットに付属のシリンジでゲルマトリックスをチップにロードするために使用され、RNA、DNA、およびタンパク質アッセイに使用されます。プライミングステーション、ストップウォッチ、シリンジクリップ1個付属
電極クリーナーキット	アジレント・テクノロジーズ(株)	〒5065-9951	クロスコンタミネーションを防止します。電極から細菌やタンパク質の汚染物質を除去します。
ゲルマトリックス用フィルター	アジレント・テクノロジーズ(株)	〒185-5990	DNA色素濃縮物とDNAゲルマトリックスの適切な混合に使用されます
IKAベーシックチップボルテックス	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Bioanalyzerアッセイチップ上のDNAラダーとDNAサンプルの適切な混合に使用
50mlの遠心分離管
エタノール(96〜100%)
56°Cの加熱ブロックまたは同様のもの(2 mlの収集チューブを保持可能)
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)
ピペット(調整可能)
滅菌ピペットチップ(クロスコンタミネーションを防ぐために、エアロゾルバリア付きのピペットチップをお勧めします)
50 mLの遠心分離チューブを60°Cで保持できるウォーターバスまたは加熱ブロック