Droplet Digital Polymerase Chain Reaction:希少腫瘍変異検出のためのナノDroplet PCR反応作製法

要約

出典:Bonner, E. R. et al.患者の体液中の腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、デジタルポリメラーゼ連鎖反応またはdPCRによって標的核酸を検出するための乳化ナノ液滴を生成する手順を段階的に紹介します。

プロトコル

>1. dPCR法による標的DNAの検出と定量

1. 220 μL のジェノタイピングマスターミックス、10 μM の野生型および変異プローブ各 8.8 μL、10 μM フォワードプライマーおよびリバースプライマー各 39.6 μL、および 17.6 μL の液滴安定化オイルを添加して、PCR ストリップチューブ 8 ウェルに 10% を追加 10% の dPCR 反応混合物を調製します。
2. dPCR反応混合物を、全容量を10〜20回ピペッティングして穏やかに混合します。液滴安定化油を反応混合物に添加した後は、ボルテックスまたは遠心分離しないでください。
3. PCR 8ウェルストリップチューブを取り出し、38 μLのdPCR反応混合物を各ウェルの底に直接分注します。清潔なピペットチップで気泡を取り除きます.
   注:PCRストリップチューブがインターロックされたり、密集したりしていると、静電気が発生し、dPCRデータの解析時に合体やノイズの多い信号が発生する可能性があります。これを避けるために、チューブを別々のバイオハザードバッグに詰め込み、バッグを詰めすぎないようにし、チューブがこすれないようにします。
4. 12 μLの増幅済みDNAサンプルをPCRストリップチューブの適切なウェルに加えます。ネガティブコントロールには、12 μL の MB H₂O.
   を添加します 注:複製ウェル内のcfDNAサンプルを分析します。CSFの場合は少なくとも2回に分けて分析し、血漿/血清の場合は各サンプルを3回に分けて分析します。
5. 全容量を10回静かにピペットで上下させ、反応混合物をDNAサンプルと混合します。
6. 新しい液滴生成装置チップを入手し、PCRストリップチューブのウェル1〜8の全容量をチップ内の対応するチャネルA〜Hにピペットで移します。ピペットチップでチャネルの底部に触れないでください。
7. 新しいクリーンなPCRストリップチューブを入手し、液滴発生装置に挿入します。液滴生成装置チップIDをスキャンするか、手動で装置コンピュータ上のソフトウェアに入力します。8つのチャンネルそれぞれの名前を入力します。[Run の開始]をクリックして、サンプルの液滴化を開始します。
8. 液滴形成が完了したら、PCRストリップチューブを取り外し、ストリップチューブキャップを装着します。
9. ストリップチューブをサーマルサイクラーに移し、ウェルごとに80μLの水を含む別のストリップチューブとバランスを取ります。
10. サーマルサイクル条件を次のようにプログラムします:95 °Cで10分間、45サイクルで2つの温度を45サイクル:95 °Cで30秒間、アニーリング温度で2分間、98 °Cで10分間、10 °Cで保持します。
    1. ランプ速度を0.5°C/sに設定し、サンプル量を80μLに設定します。
11. サーマルサイクルが完了したら、ストリップチューブを取り外し、定量装置に移します。PCRストリップキャップを取り外し、高速キャップと交換します。
12. 定量装置と装置ソフトウェアを備えた接続されたコンピューターの電源を入れます。装置ソフトウェアを起動し、[Setup a run]をクリックします。
13. ストリップチューブを定量装置に入れます。
14. 新しい定量装置チップを入手し、チップIDを装置にスキャンまたは手動で入力します。チップを機械に挿入します。
15. チップの上に金属シールドを置き、機器の蓋を閉めます。
16. コンピュータソフトウェアで、dPCRランの名前と8つのチャネル(A〜H)のそれぞれの名前を入力します。 高速モード(高速キャップで使用する必要があります)を選択し、[開始]をクリックして定量を開始します。
17. 定量が完了したら、金属シールド(保存して再利用)を取り外し、PCRストリップチューブとチップを廃棄します。装置コンピュータでは、実行ログに各実行の結果ファイルが含まれます。各サンプルの.fcsファイルを使用して、分析ソフトウェアで分析します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
レインダンス 消耗品キット	バイオ・ラッド	〒20-04411	液滴発生装置チップ、定量装置チップ、高速キャップを含むPCRストリップキャップ、液滴安定化オイルを含有
Raindance Senseインストゥルメント	バイオ・ラッド		定量機器
レインダンスソースインストゥルメント	バイオ・ラッド		液滴発生装置
RainDrop Analyst II ソフトウェア	レインダンステクノロジーズ		データ分析に使用するアナリストソフトウェア
サーモミキサーC	エッペンドルフ	14 285 562午後
MiniAmpサーマルサイクラー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A37834 (英語)
PCR 8ウェルストリップチューブキャップ	VWRの	10011-786
PCR 8ウェルストリップチューブ	アクシゲン	PCR-0208-C
Q5ホットスタートハイファイ2xマスターミックス	ニューイングランドバイオラボ株式会社	M0494S