MSC播種足場調製:マウスモデルへの外科的移植のための間葉系幹細胞播種足場を調製する技術

要約

出典: Sheets, K. T. et al. Image-Guided Resection of Glioblastoma and Intracranial Implantation of Therapeutic Stem Cell-seeded Scaffolds. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオでは、間葉系幹細胞(MSC)を生分解性のポリ(乳酸)(PLA)足場に播種する技術について説明しています。調製された足場は、脳の外科的切除腔に埋め込むことができ、そこから腫瘍病巣に向かって移動する可能性があります。さらに、これらの細胞は、がん細胞のアポトーシスを刺激する治療用タンパク質を発現するように操作することができます。

プロトコル

1. 細胞培養と足場の準備

>注:足場は、マウスに移植する48時間前に準備する必要があります。次のボリュームは、スキャフォールドごとに提供されます。必要に応じて、追加のスキャフォールドに数量を掛けます。

1. ポリ(乳酸)(PLA)足場を切除キャビティサイズ(約2mm×2mm)に切断します。足場は、ハサミを使用して手作業で切断するか、再現性のために穴あけパンチを使用して切断できます。
2. 70%エタノールに15分間浸漬し、続いてPBSに浸して滅菌します。播種用の細胞を準備しながら、10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)に足場を置きます。
3. 0.05%トリプシン(T75フラスコの場合は3〜5 mL)を使用して培養MSCを持ち上げます。37°Cで5分間インキュベートします。細胞が浮き上がったことを確認してから、フラスコに7〜10 mLのDMEMを加えてトリプシンを不活性化します。
4. フラスコの内容物を15 mLの遠心分離チューブに移します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。各足場に5 x 10⁵ MSCをペレット状に、100 x gで5分間遠心分離します。
5. 上清を吸引し、5 x 10⁵細胞あたり5 μL DMEMにMSCを再懸濁します。
6. 足場を軽くたたいて乾かして、播種用の準備をします。
   1. 鉗子によるDMEM浸漬から足場を取り外し、6ウェルプレートの蓋に一時的に置きます。足場を持ち上げて蓋から外し、余分なDMEMの液滴を残します。
   2. 足場を再び蓋に戻し、新しい乾燥した場所に置きます。3〜5回繰り返してから、部分的に乾燥した足場を新しい6ウェルプレートに入れて播種します。各スキャフォールドに対して繰り返します.
      手記：部分的に乾燥した足場は、最適な細胞播種結果を提供します。足場が湿りすぎていると、細胞が足場から滑り落ちて下のウェルプレートに付着します。足場が乾燥しすぎると、液滴が足場全体に広がらず、初期細胞の分布が悪くなります。
7. ピペットを使用して、幹細胞のバイアルを穏やかに混合し、一部の細胞が底に沈殿した可能性があるため、懸濁液を均質化します。
8. 新たに混合したMSC懸濁液2.5μLを足場に直接ゆっくりとピペットで移し、足場の上部に小さな液滴を作ります。
9. 各ウェルのエッジに300 μL DMEMを添加します。これにより、細胞滴の急速な蒸発を防ぐことができます。37°Cで30分間インキュベートし、細胞をスキャフォールドに付着させます。
10. 鉗子を使用して、ウェルプレートの足場をそっと裏返します。新たに混合したMSC懸濁液2.5μLを播種します(これにより、足場ごとに合計5 x 10⁵個の細胞が播種されます)。37°Cで30分間インキュベートし、細胞をスキャフォールドに付着させます。
11. 6ウェルプレートの各ウェルに2 mLを加えて、DMEMで足場を覆います。足場をそっと持ち上げて、メディアが足場の下を流れるようにします。この状態で37°Cで48時間インキュベートしてから、移植手術を行います。
12. 24時間後に足場を確認し、pHの不均衡による過剰な蒸発や変色が観察された場合は、メディアを追加/交換します。