出典:Benitez, J. A. et al.神経膠芽腫異種移植片の生体内イメージングのための蛍光分子断層撮影法。 J. Vis. Exp.(2018年)
このビデオでは、神経膠腫細胞を遺伝子操作して赤外線蛍光タンパク質またはiRFPを発現させるためのプロトコルについて説明します。これらの蛍光タグ付き神経膠腫細胞は、脳腫瘍の発生を理解するための深部組織イメージングに有用です。
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方法論記事
神経膠腫細胞の蛍光標識:深部組織イメージングのための蛍光タンパク質を発現する神経膠腫細胞を得るためのレンチウイルスベクターベースのトランスフェクション法
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. FP635またはFP720コンストラクトによる膠芽腫細胞の標識
- 以下に説明するプロトコルに従ってレンチウイルスを製造および精製します。
- 1日目に播種された料理を観察します。細胞が80〜90%コンフルエントになると、トランスフェクションの準備が整います.
注:細胞にはまだ1〜2回の細胞分裂を起こす余地が必要です - 4つのプラスミドを50mLのチューブに分注して、プラスミドミックスを調製します。12 cm × 15 cm のディッシュ調製には、270 μg のトランスファーベクター、176 μg の pMDL(Gag/Pol)、95 μg の pVSVG(水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質)、および 68 μg の pREV を使用します。
- 13.5 mLの0.25M CaCl2(ろ過したddH2Oで希釈)を調製し、プラスミドミックスに加えます。13.5 mLの2×BBS溶液を加えます。数回反転させて穏やかに混合し、室温(22〜26°)で15分間インキュベートします。
- トランスフェクション混合物(滴単位で広がる)を各プレート(プレートあたり2.25 mL)に加えます。プレートを穏やかに渦巻かせ、3% CO2, 37°Cで一晩(16〜20時間)インキュベー トします。
- 細胞を観察します。それらは合流点に達しているはずです。可視マーカー(GFPなど)がレンチベクタープラスミドに存在する場合、トランスフェクション効率を視覚的に評価できます。トランスフェクション効率は>90%が理想的です。
- 培地を取り出し、15 mLの新鮮なDMEM + 2% FBSを各ディッシュに加え、10% CO2、37°Cに移します。
- 上清の最初の収穫を収集する:皿から上清(12皿×15ml /皿= 180mL)を収集してプールします。
- 各皿に15mLの新鮮なDMEM + 2%FBSを加えます。10% CO2、37°Cで一晩インキュベートします。レンチウイルス上清の入った容器は、二次封じ込め(密封されたビニール袋で十分です)に入れ、4°Cで保存する必要があります。
- ウイルス調製物を濃縮する:超遠心分離によりウイルス粒子を濃縮します。上清を70,000 x gで2時間、20°Cで遠心分離します。円錐形のチューブ(丸底のチューブとは対照的に)とスイングバケットローター(固定角ローターとは対照的に)が推奨されます(この組み合わせにより、ほとんど見えないペレットを見つけやすくなるためです)。ベックマンSW28ローター(6本分の容量)を搭載した円錐形のチューブを19,400 r.p.m.、20°Cで2時間使用し、チューブに30mLの上清を充填します。12 cm × 15 cm のディッシュ調製物からの上清の総量は 360 mL です。したがって、フルボリュームを処理するには、2回連続してスピンする必要があります。チューブをロードし、最初のスピンを行い、ペレットを乱さずに上清を注ぎ、新鮮なウイルス上清を再ロードして、2回目のスピンを実行します。
- 上澄みを注ぎ、逆さにしたチューブをペーパータオルの上に置いて、残りの液体を排出します。ペレットからすべての液体を取り除くために、吸引器を使用して残りの液滴を吸い上げます。ペレットは、小さな半透明のスポットとしてかろうじて見える必要があります。
- ウイルスペレットを1× HBSSの100 μLに再懸濁します。泡立てないでください。チューブを100μLの1×HBSSですすいでください。両方の容量をプールして、最終容量200 μLを取得します。
- スクリューキャップマイクロチューブに移し、パラフィルムで包み、低速で15〜30分間ボルテックスします。再懸濁されたウイルス調製物は、透明からわずかに乳白色までどこにでも見えます。
- 卓上型マイクロ遠心分離機で10秒間回転させて、懸濁液をクリアにします。上清を新しいスクリューキャップマイクロチューブに移します。上清を20μLアリコートにします。このウイルス上清はin vitroグレードの品質です。
- 1日目に播種された料理を観察します。細胞が80〜90%コンフルエントになると、トランスフェクションの準備が整います.
- ヒト神経膠腫細胞株の約 2.0 × 10 6 細胞を DMEM と 10% ウシ胎児血清 (FBS) を 15 cm ディッシュで培養するか、2.0 × 106 ヒト神経膠腫患者由来 (GBM-PDX) 球体を DMEM/F12 1:1 培地で培養し、B27 サプリメントとヒト組換え上皮成長因子 (EGF; 20 ng/mL) および FGF (10 ng/mL) を T75 フラスコで培養します。
- すべてのセルを37°C、5%CO2、および100%の相対湿度に維持します。
- セルの解離。
- 神経膠腫細胞の場合:プレートから上清を取り除き、神経膠腫細胞に3〜5mLのトリプシン1Xを追加します。
- GBM球体の場合:細胞を15 mLチューブにピペットで移して細胞を回収します。
- GBM球体を200 x gで5分間、卓上遠心分離機を使用して室温でスピンダウンします。
- 上清を取り除き、細胞剥離液を3〜5mL加えます。
- すべての細胞を37°Cで10〜15分間インキュベートします。
- ピペッティングを数回上下させて細胞を慎重に解離し(球体と神経膠腫細胞が完全に解離していることを確認してください)、200 x gで5分間スピンダウンします。
- 上清を取り除き、数回ピペッティングして5 mLの培地で細胞を再懸濁します。トリパンブルー排除により細胞生存率を判定します。
- 10 cmのディッシュに1.0 x 10 6個のターゲット細胞を5 mLの培地でピペッティングしてプレート化します。
- 蛍光タンパク質を発現するレンチウイルスを多重感染度(MOI)5で細胞に形質導入し、37°Cでインキュベートします。
- 24時間後、形質導入細胞から培地を取り出し、5 mLの新鮮な培地を加え、37°Cでさらに48時間インキュベートします。
- 上記のように、感染した細胞をトリプシンを使用して単一細胞懸濁液に解離します。細胞を200 x gで5分間スピンダウンし、500 μLのソーティング溶液(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と1% FBS)に再懸濁します。
- 細胞懸濁液をFACSチューブにピペットで移します。1 μL/mLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)二塩酸塩で細胞を共染色し、死細胞を排除します。フローサイトメーターのゲート(非形質導入細胞および非形質導入細胞/DAPI染色)を設定するには、ネガティブコントロールが必要です。
- 蛍光陽性/DAPI陰性の細胞を選別液に選別し、選別した細胞を15mLのコニカルチューブに集めます。
- 選別した細胞を200 x gで5分間スピンダウンし、上清を取り除き、5 mLの培地に再懸濁します。選別した細胞をピペッティングで10cmの皿に播種します。37°Cで少なくとも48〜72時間インキュベートします。
- 上記のように細胞を解離し、in vivo実験のために複数の皿にプレーティングすることにより、選別された細胞を増殖させます。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM/高グルコース | ハイクローン/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | ギブコ | 11320-082 | |
| FBSの | ハイクローン/GE | 03 SH30071 | |
| アキュターゼ | 革新的な細胞技術 | AT-104 | |
| トリプシン | ハイクローン/GE | 01 SH30236 | |
| B27サプリメント | ギブコ | 17504044 | |
| ヒト組換えEGF | ステムセルテクノロジー | 2633 | |
| ヒト組換えFGF | ステムセルテクノロジー | 2634 | |
| DPBSの | コーニング | 21-031-00 | |
| FACSチューブ | 隼 | 352235 | |
| ダピ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 62248 | |
| p24 エリーサ | クロンテック | 632200 | |
| セルソーター | ソニー | SH8007 | |
| 超遠心分離機 Optima L-80 XP | ベックマン・コールター | 392049 | |
| ティッシュカルチャー 100mmディッシュ | オリンパスのプラスチック | 25〜202 | |
| ティッシュカルチャー 150mmディッシュ | オリンパスのプラスチック | 25〜203 | |
| 組織培養フラスコT75 | コーニング | 430720ユーメン | |
| 50 mLコニカルチューブ | コーニング | 430290 | |
| プラスミド:レンチウイルス転写ベクター | ヴァーマ研究所 ソーク生物学研究所 | ||
| レンチウイルスパッケージングベクター | pMDL pRev および pVSVG | 品番:K4975-00 | |
| エンドトキシンフリーのmaxipreps | エンドフリーマキシプレップキット キアゲン | 12632 | |
| 1X — HBSS (英語) | インビトゲン | 14025-092 | |
| 15cm組織培養皿 | |||
| 0.45μmフィルターユニット 容量500mL | |||
| 円錐底部超遠心チューブ | ベックマン | 358126 | |
| 丸底超遠心チューブ | ベックマン | 326819 | |
| 24ウェル組織培養プレート | |||
| 蛍光顕微鏡 | |||
| マルチチャンネルピペッター | |||
| ELISAマイクロプレートリーダー |
