薬物治療研究のための脳腫瘍幹細胞(BTSC)移動アッセイ:BTSCの移動に対する薬物治療の影響を分析するためのIn vitro生細胞イメージング技術

要約

出典:Restall, I. et al.神経膠芽腫、脳腫瘍、幹細胞の移動および浸潤を研究するための生細胞イメージングアッセイ。J. Vis. Exp.(2018年)

この動画では、走化性マイグレーションプレートを用いて、目的の薬剤が生きた脳腫瘍幹細胞のマイグレーションに及ぼす影響を解析する脳腫瘍幹細胞マイグレーションアッセイを行っています。ライブセルイメージングは、アッセイ中の細胞移動の可視化と定量化を容易にします。

プロトコル

1. 脳腫瘍幹細胞遊走アッセイ

1. T25フラスコに200,000個の細胞を8 mLの完全培地に播種し、1〜2週間前に遊走アッセイを実施します><。 手記：プレーティングからアッセイの実施までの時間は、使用するBTSC培養物の増殖速度によって異なります。
   1. 遊走に対する薬物治療の効果をテストするには、DMSOなどの適切なビヒクルと目的の薬物で細胞を前処理し、ビヒクルまたは薬物ストックの適切な量を細胞を含む培地の別々のウェルに直接追加します。
2. 走化性移行プレート(図1A)をコラーゲンの薄層でコーティングして準備します。
   1. コラーゲンでコーティングする必要がある96ウェル走化性プレートのウェル数を計算します。各条件に少なくとも 3 つのレプリケートウェルを含めます。
   2. I型コラーゲンのストック5 mg/mLを、培養グレードの水で0.14%に希釈した純粋な酢酸で0.2 mg/mLに希釈します。
   3. 0.2 mg/mLのコラーゲンを、使用されているメンブレンインサートウェルとボトムリザーバーウェルの両方にピペットで注入します。
      手記：プレートの底部のリザーバーには225μL、メンブレンインサートウェルには75μLのコラーゲンが必要です。
   4. マイグレーションプレートをインキュベーターに37°Cで1時間置き、コラーゲンコーティングを傷つけずにウェルからコラーゲン溶液を吸引します。
   5. ウェルを滅菌した1x PBSで2回洗浄します。プレートをすぐに使用しない場合は、PBSを吸引し、4°Cで最大2週間保存してください。使用前に、走化性移行プレートを室温まで温めてください。
3. 走化性マイグレーションプレートの底部リザーバーを準備します。
   1. 走化性物質として10%FBSを補充した培地225μL(成長因子なし)を、走化性移動プレートの底部リザーバーウェルにピペット
   で移します。
   2. 気泡が発生しないように、メンブレンインサートを下部リザーバーに斜めにそっと置きます。
4. 走化性移行プレートのメンブレンインサートに細胞をプレートします。
   1. 解離したBTSCを培地(成長因子なし)に50,000細胞/mLの細胞密度で再懸濁します。さまざまな薬物治療中の移動を評価する場合は、メディアに薬物を追加します。あるいは、前処理した細胞とコントロール細胞を同数播種し、めっき時には最終的な薬物濃度を維持します。
   2. ステップ1.4.1のBTSC50μLを、所望の処理条件下で移行プレートの各ウェルにプレート化します。
5. 走化性移動をイメージしてください。
   1. 走化性マイグレーションプレートをライブセルイメージングシステムにセットし、自動イメージングソフトウェアを設定して、プレートの顕微鏡画像を1〜2時間ごとに最大72時間取得します。市販のソフトウェア(資料の表を参照)を使用して、タイムラインを右クリックし、スキャン間隔を2時間ごとに24時間に設定します
      手記：時間間隔と合計経過時間は、使用される BTSC カルチャによって異なります。個々のBTSC培養で経験が積まれるまで、72時間2時間間隔で開始します。自動イメージングシステムが利用できない場合は、イメージングソフトウェアに接続された顕微鏡とカメラを使用して、同じ視野の画像を手動で取得できます。
   2. 画像取得が完了したら、実験全体の画像を取得し、メンブレンの背景と遊走孔から細胞を分化する解析ソフトウェアを使用して処理定義を作成します(図1B、赤マスク)。市販のソフトウェア (資料の表を参照) を使用して、新しい処理定義を選択し、BTSC の処理定義設定をシードしきい値 52、成長しきい値 85、サイズ (ピクセル) の調整を -1、最小面積を 200 μm² に設定します.この処理定義をメンブレンの底面に適用します。この解析で細胞が背景の膜と正確に区別されない場合は、この解析を修正してください。
   3. 3つの複製ウェルのそれぞれについて、メンブレンの底面の細胞表面積としてデータを収集し、細孔を通って移動した細胞のみをカウントします。細胞の移動をμm²(移動した細胞の面積)の経時的なグラフ化(図1C)
      手記：最初の時点でメンブレンの上面にプレーティングおよびカウントされた細胞の相対数が、すべての処理条件間で類似している(すべてのウェルで20%未満の変動)ことを確認し、不均一なプレーティングの影響を回避します。商用ソフトウェア(資料表を参照)を使用したデータ収集は、手順1.5.2で作成した処理定義を起動し、「メトリック」をクリックし、「グラフ/エクスポート」をクリックし、「データのエクスポート」をクリックすることで実行できます。

結果

図1:BTSC遊走の生細胞イメージング (A)これは、BTSCによる遊走アッセイを行う前に、I型コラーゲンの薄層でコーティングされた96ウェル走化性遊走プレートの例です。画像は、i)3つの部分(蓋、メンブレンインサート、リザーバー)すべてが一緒に配置されたプレート、ii)3つの部分すべてが分離されている、iii)メンブレンインサートの上面図のクローズアップ画像、iv)メンブレンインサートの底面図のクローズアップ画像、v)底部リザーバーのクローズアップ画像を示しています。(B)これらは、実験の開始時(0時間)と24時間でのBTSC移動の代表的な画像です。画像の焦点は、細胞が最初にプレーティングされたメンブレンインサートの上部にあります。走化性移動プレートの底部に移動した細胞は、赤で強調表示されます...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マトリゲル基底行列	コーニング	356230
96ウェルプレート	エッペンドルフ	30730119
T25 Nunc EasYFlask	サーモフィッシャー	156367
ファルコン 15 mL コニカルチューブ	サーモフィッシャー	352096
Incucyte ClearView 96ウェル走化性プレート	エッセンバイオサイエンス	4582
IncuCyte Zoomライブセル解析システム	エッセンバイオサイエンス	4545
IncuCyte Zoomライブセル解析ソフトウェア	エッセンバイオサイエンス	2016A リビジョン1
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	シグマ	D8537
培養グレードの水	ロンザ・ビオウィテカー	17-724Q
ウシ胎児血清(FBS)	インビトゲン	〒12483-020
ラットコラーゲンI	トレビゲン	3440-100-01
Accumax細胞剥離ソリューション	革新的なセル技術	AM105

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