脳腫瘍幹細胞(BTSC)ニューロスフェア侵襲アッセイ:ニューロスフェアからのBTSC浸潤に対する薬物治療の効果を分析するためのインビトロアッセイ

要約

出典: Restall, I. et al. Live-Cell imaging assays to study glioblastoma brain tumor stem cell migration and evagen. J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、生細胞イメージング技術を介して神経圏からのBTSCの浸潤能力に対する薬物治療の効果を決定するためのin vitro脳腫瘍幹細胞(BTSC)浸潤アッセイを示しています。

プロトコル

1. 脳腫瘍幹細胞ニューロスフェア浸潤アッセイ

1. インベージョンアッセイの実施を計画する1〜2週間前に、T25フラスコの8 mLの完全培地に200,000個の細胞を播種します><。 手記：プレーティングからアッセイの実施までのタイミングは、使用するBTSC培養物の増殖速度によって異なります。
   1. 前処理された細胞については、ニューロスフェアを浸潤のためにプレーティングする準備が整う前に、所望の濃度で目的の化合物をフラスコに添加します。
2. 平均ニューロスフェアのサイズが約150〜200μmになるまで待ちます;通常、これは使用するBTSC培養物にもよりますが、7〜14日かかります。
   手記：フラスコ内の球のサイズの分布を観察するのが一般的です。
3. フラスコを傾けてピペットで穏やかに混合し、各治療条件ごとに500μLのBTSCニューロスフェアを1.5mLのコニカルチューブに移します。これは、3つのレプリケートウェルをプレートするために使用されます。
   注:ステップ1.3.1〜1.3.2はオプションですが、新しいBTSC文化の最初の侵入実験に推奨されます。
   1. ウェルに入るニューロスフェアの密度を測定するには、ステップ1.3のように1.5mLのチューブを準備します。ニューロスフェアを静かに混合し、100 μLを別の96ウェルプレートに移し、ニューロスフェアが重力によって5分間沈殿するのを待ちます。
   2. 顕微鏡でニューロスフィアの数を確認し、複数のニューロスフェアがウェルの領域に過密にならずに画像化されていることを確認します。
      手記：侵入するニューロスフェアは、隣接するニューロスフェアと相互作用することなく、直径を3倍にするのに十分なスペースを必要とします。ウェルあたりのニューロスフェアの数は、ウェルあたりのニューロスフェアの数をカウントし、ステップ1.3でT25フラスコから1.5mLコニカルチューブにニューロスフェアを追加するか減らすことで調整できます。
4. ステップ 1.3 の細胞を入れた 1.5 mL コニカルチューブを氷上に配置し、ステップ 1.5 〜 1.7 を氷上で実行します。
5. ニューロスフェアを重力によって1.5mLコニカルチューブの底に5分間沈殿させ、標識された96ウェルプレートを氷上で予冷します。
6. 細胞外マトリックスタンパク質のニューロスフェアを再懸濁します。
   1. 各治療条件について、氷上に0.4 mg/mLのI型コラーゲン溶液500 μLを調製します:培地459 μL(成長因子なし)、5 mg/mLコラーゲンストック溶液40 μL、滅菌1N NaOH0.92 μLを加えます(表1).
      注:治療条件ごとに500μLのコラーゲン溶液が必要です:3つの複製ウェルのそれぞれに100μL、過剰に200μL。薬物治療は、溶液の培地成分から差し引いた所望の最終濃度でここに添加する必要があります。このプロトコルでは、細胞外マトリックスタンパク質としてのI型コラーゲンの使用について説明しています。ただし、任意の細胞外マトリックスタンパク質を試験できます。また、浸潤速度が遅いBTSC培養物については、増殖因子やFBSを培地で補うことで、浸潤率を高めることができます。
   2. ステップ1.5のニューロスフェアが落ち着いたら、底部に沈殿したニューロスフェアペレットを失うことなく、できるだけ多くのメディアを吸引します。ステップ1.6.1で調製したコラーゲン溶液500μLにニューロスフェアを穏やかに再懸濁します。
7. 100 μLのコラーゲンとニューロスフェアの混合物を、氷上の96ウェルプレートの3つのレプリケートウェルに加えます。ニューロスフィアを氷の上に5分間落ち着かせます。
8. 96ウェルプレートを37°Cのインキュベーターに5分間移し、コラーゲン重合を行います。
9. すぐに96ウェルプレートをイメージングする準備をします。
   1. 96ウェルプレートを生細胞イメージングシステムのトレイまたは顕微鏡のステージに置いて、浸潤が始まる前に、プレーティング時のニューロスフェアサイズの基準となる画像を取得します。
   2. 侵入速度が頭打ちになるまで、1時間ごとに画像を取得します。通常、これは24時間以内に行われます
      手記：イメージング間隔は、使用する機器に応じて変更できます。イメージング間隔と合計経過時間は、浸潤速度が異なるBTSC培養物に対しても変更できます。
10. BTSCが時間の経過とともにマトリックスに侵入するときのBTSCの表面積の増加を決定します。
    手記：3つの複製ウェルの平均として計算されるプレーティング時の細胞の表面積は、BTSC浸潤の違いがプレーティングされたニューロスフェアの数やサイズに強く影響されないように、異なる処理条件間で類似している(すべてのウェルで20%未満の変動)必要があります。
    1. 生細胞解析システムでは、画像取得に10倍対物レンズを使用し、3つのリピートウェルのウェルごとに4つの画像を取得します。ウェルのコンフルエンス率として表される相対的なセル表面積を決定するには、ウェルの背景上でセルを具体的に強調表示する処理定義を設定します。市販のソフトウェア(材料表を参照)を使用して、新しい処理定義を選択し、セグメンテーション調整を0.8に、最小面積を300μm2に、最大偏心を0.99に設定します。セルと背景が正確に区別されない場合は、この分析を変更します。
       手記：他の方法を使用してニューロスフェアの侵入を経時的に画像化する場合は、3つのレプリケートウェルの複数の視野を経時的に取得することをお勧めします。ただし、各間隔でまったく同じ視野をイメージングしないと、収集されるデータの標準誤差が増加します。コンピュータソフトウェアを使用して、各画像内の侵入細胞の表面積を測定できます。
    2. 各時点における各ウェルの総細胞表面積(相対的または絶対的)としてデータを収集し、3つの反復ウェルの平均を決定します。BTSCの浸潤をグラフ化し、時間の経過とともに増加する細胞面積をプロットします。

名 名 名

コラーゲン溶液の調製
原剤 [コラーゲン] (mg/mL)	5
最終 [コラーゲン] (mg/mL)	0.4
必要な井戸の数:	5
総容量 (μL)	500
ストックコラーゲンの量(μL)	40
1N NaOHの体積(μL)	0.92
メディア容量(μL)	459

表1:0.4 mg / mL I型コラーゲン溶液の調製。I型コラーゲン溶液の既知の開始濃度と望ましい最終濃度がリストされています。記載されている容量は、ニューロスフェアを3つのレプリケートウェルにプレートするのに十分であり、さらに2つの過剰ウェルにプレートするのに十分であり、プロトコルステップ1で詳細に説明されているように、単一の治療条件を含めることができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ラットコラーゲンI	トレビゲン	3440-100-01
NaOH	VWRの	BDH3247-1
酢酸	ミリポアシグマ	AX0073から6
96ウェルプレート	エッペンドルフ	30730119
T25 Nunc EasYFlask	サーモフィッシャー	156367
ファルコン 15 mL コニカルチューブ	サーモフィッシャー	352096
Incucyte ClearView 96ウェル走化性プレート	エッセンバイオサイエンス	4582
IncuCyte Zoomライブセル解析システム	エッセンバイオサイエンス	4545
IncuCyte Zoomライブセル解析ソフトウェア	エッセンバイオサイエンス	2016A リビジョン1
ペニシリン、ストレプトマイシン	シグマ	P4333
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	シグマ	D8537
ウシ胎児血清(FBS)	インビトゲン	〒12483-020

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