パターン化ニューロン上の神経膠芽腫細胞の共培養:ラット海馬ニューロン上の神経膠芽腫細胞の移動をin vitroでモニターする技術

要約

出典: Guyon, J. et al. Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions. J. Vis. Exp. (2021年)

このビデオは、神経膠芽腫幹様細胞が腫瘍周囲腔のニューロン上を移動するときに、有髄ニューロン路の浸潤を模倣する、マイクロパターンニューロン上の神経膠芽腫細胞の共培養アッセイについて説明しています。このアッセイは、神経膠腫のニューロンに対する膠芽腫細胞の遊走を阻害する薬理学的薬剤の効果を解析するのに役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. パターン化されたスライドの準備

1. マイクロパターニングのための基板調製
   1. 18 mmの円形ガラスカバースリップを空気/プラズマ活性化で5分間処理し、カバースリップを100 μLの(3-アミノプロピル)トリエトキシシランを含む閉室チャンバーにデシケーターで1時間
   置きます。
   2. 100 mg/mLのポリ(エチレングリコール)-スクシンイミジル吉草酸エステル(分子量5,000(Peg-SVA))と10 mM炭酸塩緩衝液、pH > 8で1時間インキュベートします。超純水で十分にすすぎ、化学フードの下で乾燥させます
      手記：この段階では、サンプルを4°Cの暗所で保存して、さらに使用することができます。
   3. 光開始剤である4-ベンゾイルベンゾイルトリメチルアンモニウムクロリド(PLPP)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に14.7 mg / mLで添加します
      手記：PLPPの濃縮形態であるPLPPゲルも使用できます。これにより、PEGブラシの劣化に必要な紫外線(UV)照射時間が短縮されます(100 mJ/mm²)。
2. 光開始剤ゲル堆積
   1. 3 μL の PLPP ゲルと 50 μL の無水エタノールの混合物を調製し、スライドの中央に堆積します。無水エタノールが完全に蒸発するまで、サンプルを化学フードの下に置きます.
      手記：この段階では、サンプルを4°Cの暗所で保存して、さらに使用することができます。
3. スライドガラスマイクロパターニング
   1. カバースリップをLudinチャンバーに取り付け、オートフォーカスシステムを搭載した顕微鏡の電動ステージに置きます。
   2. 想定されたマイクロパターンに対応する画像をソフトウェアにロードします。これらのパラメータを適用します:レプリケーション4 x 4回、間隔200μm、UV線量1,000 mJ / mm²。自動UV照明シーケンスの後、PLPPを複数回のPBS洗浄で洗い流します.
      手記：PLPPゲルを使用した場合は、脱イオン水で広範囲に洗浄して除去し、N₂の流れで乾燥させ、4°Cで保存してください。
   3. ラミニン(PBS中50 μg/mL)と30分間インキュベートし、PBSで広範囲に洗浄します
      注:精製された緑色蛍光タンパク質(GFP、PBS中10μg / mL)の蛍光溶液をラミニンと混合して、蛍光顕微鏡でマイクロパターンを視覚化できます。

2. 共培養のためのニューロンとGBM細胞の調製

1. 胚ラット海馬ニューロンの培養
   1. 胚性(E18)ラットの海馬を解剖し、組織をハンク平衡塩溶液(HBSS)/1mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)/ペニシリン-ストレプトマイシン溶液に15mLチューブで移します。海馬を乾燥させずに余分な溶液を取り除きます。
   2. ペニシリン(10,000単位/mL)/ストレプトマイシン(10,000 μg/mL)と1 mM HEPESを添加したトリプシン-エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)5 mLを加え、37°Cで15分間インキュベートします。HBSS/HEPES/ペニシリン-ストレプトマイシン溶液で2回洗浄し、組織をこの溶液に2〜3分間放置します。
   3. 2つの炎研磨パスツールピペットを使用して、各組織で10回上下にピペッティングし、泡立ちを最小限に抑えるように注意しながら、組織を解離します。細胞をカウントし、細胞懸濁液の生存率を評価します。以下に示すように、ニューロンをマイクロパターンのカバースリップにプレートします.
      手記：抽出後の細胞生存率は85〜90%です。
2. マイクロパターンカバースリップ上のニューロンの細胞培養
   1. マイクロパターン化されたスライドガラスをPBSで再水和し、完全なニューロン細胞培養培地をインキュベートします。
   2. E18 Sprague-Dawleyラットから得られた海馬ニューロンを、3%ウマ血清を豊富に含む神経基礎培地(NBM)中のマイクロパターンガラスカバースリップに直接播種します。マイクロパターン化されたニューロンをインキュベーター(37°C、5%CO₂)に48時間
      手記：~6時間後、初代海馬ニューロンがラミニンマイクロパターンに付着しているのが見られます。
3. ニューロン上でのヒトGBM幹様細胞の共培養
   1. スフェロイド形状の細胞が懸濁液中で増殖するにつれて、懸濁液を200 × gで5分間遠心分離します。スフェロイドを5 mLのPBSで洗浄し、細胞を0.5 mLの細胞解離試薬(材料表を参照)と37°Cで5分間インキュベー
   トします。
   2. 4.5 mLの完全NBM(前述のように、B27サプリメント、ヘパリン、線維芽細胞成長因子2、ペニシリン、およびストレプトマイシンで補完)を添加し、自動カウント技術を使用して細胞をカウントします。
   3. 3%ウマ血清を豊富に含んだNBMのマイクロパターン化ニューロン培養物に1,000GBM細胞を播種します。プレートを37°C、5%CO₂、湿度95%でインキュベートします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン	シグマ	440140-100ミリリットル	アミノ基は、mPEG-SVAの生体結合に有用
96ウェル丸底プレート	ザルシュテット	2582624	スフェロイドの調製に使用
アキュターゼ	ギブコ	A11105-01	-20°C(長期)または4°C(短期)で保存、球体解離酵素
B27	ギブコ	12587	-20°Cで保存し、使用前に解凍
基本的な線維芽細胞成長因子	ペプロテック	100-18B	-20°Cで保存し、使用前に解凍
Countess Cell Counting Chamber スライド	インビトゲン	C10283	細胞カウントに使用
カバースリップ	マリエンフェルド	111580	細胞培養基質
デシケーターカートリッジ	シグマ	Z363456-6EA	(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン処理中の水分を減らすために使用されます
DPBSの10倍	パンバイオテクノロジー	品番04-53-500	4°Cで保存
フラスコ 75 cm²	隼	10497302
HBSSの	シグマ	H8264-500ミリリットル
ヘパリンナトリウム	シグマ	H3149-100KUさん	4°Cで保存
ラミニン		114956-81-9	ニューロンの接着を促進します
フラスコ 75 cm²	隼	10497302
ヘパリンナトリウム	シグマ	H3149-100KUさん	4°Cで保存
Leonardoソフトウェア			想定されるマイクロパターンのロード
MetaMorphソフトウェア	モレキュラーデバイス合同会社	NAの	顕微鏡自動化ソフトウェア
メチルセルロース	シグマ	M0512	NBMで希釈して最終濃度を2%に
神経基礎媒体	ギブコ	21103-049	4°Cで保存
ニコン TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)			電動ステージを備えた倒立顕微鏡
ペニシリン - ストレプトマイシン	ギブコ	15140-122	4°Cで保存
PLPP	肺胞		PEGブラシの劣化に使用される光開始剤
ポリ(エチレングリコール)-吉草酸エスクリンシンイミジル(mPEG-SVA)	レイサンバイオ	VA-PEG-VA-5000-5g	防汚コーティングとして使用
トリプシン-EDTA	シグマ	T4049-100ミリリットル	接着細胞の剥離に使用

です さん してください してください の