初代脳周皮細胞の単離と培養:内皮細胞汚染なしにウシ脳毛細血管から周皮細胞を単離および培養する手順

要約

出典:Hørlyck, S. et al. 細胞質カルシウム測定およびカルシウムイメージング研究のための脳毛細血管周皮細胞の培養。J. Vis. Exp. (2020年度)

このビデオでは、内皮細胞の汚染なしにウシの脳毛細血管から周皮細胞を分離して培養する手順を示しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ウシ毛細血管の播種と培養

1. 0日目:0.7mLのコラーゲンIVストックと6.3mLのPBSを混合します。溶液をT75フラスコに加え、フラスコを室温(RT)で2時間放置するか、4°Cで一晩放置します。
2. フラスコからコラーゲン溶液を取り出し、PBSで3回洗います。
3. 7 mLのフィブロネクチン作業溶液を加え、フラスコを室温で30分間放置します。次に、フィブロネクチン溶液を取り除き、直後に毛細血管に播種します。
4. 30分間の待ち時間の間に、キャピラリーのバイアル1本を37°Cのウォーターバスで解凍します。
5. キャピラリーが解凍されたら、すぐにDMEM-comp 30 mLを入れた遠心チューブに移し、500 x gとRTで5分間遠心分離します。DMEM-compをチューブから取り外し、キャピラリーペレットを10 mLの新鮮なDMEM-compに再懸濁します。
6. 10 mL懸濁液をコーティングされたT75フラスコに移し、キャピラリーをフラスコの底に付着させるように37°Cインキュベーターで<4〜6時間放置します> 手記：細胞増殖速度は、従来の5%_CO2よりも10%_CO2の方が高くなります。
7. インキュベーションの4〜6時間後、光学顕微鏡でフラスコを検査します。ここで、毛細血管の画分をフラスコの底に取り付けます(図1、0日目)。
8. GMを調製し、DMEN-comp培地を毛細血管から非常に注意深く吸引し、作りたてのGM10mLと交換します。
9. 2日目:毛細血管からGMを取り出し、作りたてのGM10mLと交換します。この時点で、毛細血管からの細胞増殖は光学顕微鏡で見えるはずです(図1、2〜3日目)。

2. ウシ脳毛細血管からの初代周皮細胞の単離

1. 4日目:光学顕微鏡で毛細血管を点検します
   手記：フラスコは、適切な量の周皮細胞を提供するために、約60〜70%コンフルエントになっているはずです(図1、4日目)。そうでない場合は、GMを10mLの新鮮な培地と交換し、フラスコを別の日インキュベーターに置いておきます。
2. 培地を吸引し、PBSで細胞を穏やかに洗浄します。
3. 解凍したトリプシン-EDTAを2mLの内皮細胞に加え、フラスコをインキュベーターに1〜3分間放置します。この時間帯はフラスコを頻繁に取り出し、顕微鏡で観察してください。
   手記：内皮細胞は丸められ、フラスコから分離するはずです。周皮細胞は、「ゴースト」形態を持つ細胞として見え、フラスコの表面に付着している必要があります。これは厄介で重要なステップです。周皮細胞の単一培養の汚染を避けるためには、ほとんどの内皮細胞を除去することが不可欠ですが、トリプシン化が長引くと周皮細胞が剥離することもあります。トリプシン化時間は時々わずかに異なる可能性があるため、治療中に顕微鏡でフラスコを頻繁に観察することが最も重要です。
4. 内皮細胞が丸まり始めたら、フラスコを軽くたたいて、緩んだ内皮細胞を切り離します。
5. トリプシン化を停止するには、フラスコに10 mLのDMEM-compを追加します。.フラスコを培地で数回注意深く洗い流し、内皮細胞を取り除きます。フラスコから内皮細胞懸濁液を吸引します。内皮細胞は、他の目的に使用できるようになりました。
6. フラスコにDMEM-comp 10 mLを加えます。光学顕微鏡で観察して、周皮細胞がまだ存在し、底に付着していることを確認します。フラスコをインキュベーターに戻し、周皮細胞が豊富な培養物が成長するのを待ちます
   手記：次の日は文化を観察することが重要です。まだかなりの数の内皮細胞が増殖している場合は、別のトリプシン治療を行うことができます。
7. 隔日でDMEM-comp.培地を交換することで、周皮細胞のモノカルチャーを成長させます。光学顕微鏡で細胞の増殖を確認します(図1、5〜8日目)。

結果

図1:毛細血管の培養と周皮細胞の単離。毛細血管は新鮮なウシの脳から単離され、0日目に培養フラスコに播種されています。ウシ脳毛細血管からの増殖とそれに続く周皮細胞の単離を、光学顕微鏡で数日間追跡しました。4a日目は、トリプシンで治療して内皮細胞を除去する前の内皮細胞の増殖を示し、4日目bは治療直後の残骸を示しています。8日目aは、毛細血管の残骸が見える焦点面を示していますが、8日目bは、周皮細胞の成長が見える面に焦点を当てています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PBSの	シグマ・アルドリッチ	D8537	リン酸緩衝生理食塩水
コラーゲンIV	シグマ・アルドリッチ	C5533
T-75フラスコ	シグマ・アルドリッチ	CLS3972
ウシ胎児血清(FBS)	PAA/GEヘルスケア	A15-101
フィブロネクチン	シグマ・アルドリッチ	F1141
トリプシン-EDTA	シグマ・アルドリッチ	T4299
光学顕微鏡	オリンポス	オリンパスCK2	位相差のある直立光学顕微鏡
DMSOの	シグマ・アルドリッチ	471267
ヘパリン	シグマ・アルドリッチ	H3149-J
細胞インキュベーター	サーモフィッシャー
遠心機	サーモフィッシャー	ヘレウスマルチフュージ 3SR+	細胞をスピンダウンするための標準的な大容量遠心分離機
ダルベッコのモディファイドイーグルスミディアム	シグマ・アルドリッチ	D0819
ペニシリンGナトリウム/ストレプトマイシン硫酸塩	シグマ・アルドリッチ	P0781
MEM非必須アミノ酸	シグマ・アルドリッチ	M7145