方法論記事

ヒト脳からの脳毛細血管の単離:ヒト脳組織から脳毛細血管を抽出するための最適化法

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典:Hartz, A. M. S. et al.新鮮ヒト脳組織からの脳毛細血管の分離。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、新鮮な人間の脳組織から脳毛細血管を分離する様子を示しています。その後、単離された毛細血管を使用して、ex vivo血液脳関門モデルを生成できます。

プロトコル

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人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 脳サンプル調製

>注:図1Aは、以下で説明する全体の分離手順のワークフローチャートを示しています。人間の脳組織は、皮質のどの部分からも発生する可能性があり、生のものでも冷凍でも使用できます。凍結した脳組織は室温で解凍できます(バッファーなし、10 gで~30分)。同等の結果を得るためには、各実験で同じ脳領域から脳組織を採取する必要があります。このプロトコルは、凍結されていない新鮮 (Post-Mortem Interval または PMI <4 h) ヒト大脳皮質に最適化されています。

  1. ヒト脳組織の調製:脳組織の重量を記録します。次のプロトコルのすべての数値は、10 gの新鮮なヒト脳組織に適しています。脳組織を100mmのシャーレに入れます。鉗子ですべての髄膜を慎重に取り除きます。メスを使って白質を切り取ります。
  2. 人間の脳組織のミンチ:脳組織を慎重に切り取り、メスでミンチにします。約5分間ミンチします(2〜3 mm小片)。脳組織をPotter-Elvehjem組織グラインダーに移します。30 mLのアイソレーションバッファーを加えます
    手記：ミンチの組織片は、ミンチのプロセスを通じて脳組織がどろどろに変わるため、見づらいです。

2. 均質化

  1. Potter-Elvehjemティッシュグラインダー(クリアランス:150〜230 μm):ホモジナイザー速度50rpmで各サンプルを100ストロークで均質化します。25ストロークごとの時間と100ストロークに必要な合計時間を記録します。提案された均質化プロトコルについては、表1を参照してください。10 gのヒト前頭皮質を均質化する合計時間は約22分です。気泡を防ぐために空気をかき混ぜないでください。
  2. Dounce ホモジナイザー (クリアランス: 80–130 μm): ホモジネートを氷上のDounceホモジナイザーに移します。サスペンションを 20 ストローク (~6 秒/ストローク、合計 ~2 分) で均質化します。泡を避けてください。

3. 遠心分離

  1. 脳内ホモジネートを4本の50 mL遠心分離チューブに均等に分配し、ホモジネートの総量を文書化します。50 mLの密度勾配緩衝液を遠心分離チューブに分配します(チューブあたり12.5 mL)。10 mLのアイソレーションバッファーを使用して乳棒とホモジナイザーをすすぎ、4本の遠心分離チューブに分配します(チューブあたり~2.5 mL)。
  2. 遠心分離チューブをキャップでしっかりと閉じます。チューブを激しく振って、ホモジネート、密度グラジエント培地、およびバッファーを混合します。5,800 x gで4°Cで15分間遠心分離します(固定角ローター)。ペレットをチューブに付着させたままにするために、中程度の減速速度を選択します。上清を捨て、各ペレットを1%BSAの2mLに再懸濁します。

4. ろ過

>注:赤血球や他の細胞の破片から毛細血管を分離するには、いくつかのろ過手順が必要です。

  1. 300 μmメッシュ:ペレットを再懸濁した後、300 μmメッシュで懸濁液をろ過します。毛細血管はメッシュを介してろ過されますが、より大きな血管と大きな脳の破片はメッシュ上に残ります。メッシュを最大50mLの1%BSAで慎重に洗浄します。メッシュを破棄します.
    手記：このろ過ステップにより、大きな血管や脳の破片の塊から毛細血管懸濁液が取り除かれます。
  2. 30 μM 細胞ひずみフィルター
    手記：このろ過ステップにより、毛細血管が赤血球やその他の脳の破片から分離されます。
    1. ステップ 4.1 の毛細血管濾液を 5 つの 30 μm 細胞株フィルター (細胞株フィルターあたり約 10 mL の毛細血管濾液) に分配します。毛細血管はこのフィルターによって保持されますが、赤血球、他の単一細胞、および小さな脳の破片はフィルターを通過して濾液に集められます。
    2. 各フィルターを25 mLの1% BSAで洗浄します。その後、すべての濾液を6番目のフィルターに注ぎ、歩留まりを上げます。各フィルターを50 mLの1% BSAで洗浄します。細胞株フィルターは毛細血管を封じ込めた状態で保管し、濾液は廃棄します。

5. キャピラリーコレクション

  1. フィルターを逆さまにし、各フィルターにつき50mLの1%BSAでキャピラリーを50mLチューブに洗浄します。5 mLピペッターのピペットチップで静かに圧力をかけ、フィルターを横切って動かして脳の毛細血管を洗い流します。
  2. 特にフィルターの縁から、すべての脳の毛細血管を洗い流してください。気泡はろ過プロセスがより困難になり、毛細管損失の可能性が高まるため、避けてください。

6. 洗濯

  1. キャピラリーを採取した後、すべてのサンプルを1,500 x gで4°Cで3分間遠心分離します(スイングバケットローター)。上清を取り除き、ペレットを約3 mLの分離バッファーに再懸濁します。1つのサンプルからすべての再懸濁ペレットを15 mLのコニカルチューブに結合し、アイソレーションバッファーで満たします。再度、1,500 x gで4°Cで3分間遠心分離し、さらに2回洗浄します。
  2. 顕微鏡(倍率100倍)とカメラ(図1B)でキャピラリーの純度を記録
    手記：ヒト脳組織10gからの脳毛細血管収率は、通常、約100mgである。単離された脳毛細血管は、実験に使用したり、処理(ライセート、膜単離など)したり、急速凍結して-80°Cでクライオチューブに最低6〜12か月間保存したりできます(複数回の凍結融解サイクルを避けてください)。
ストローク時間
1-257-7.5
26-505〜5.5
51-755〜5.5
76-1005〜5.5
合計時間:22-24分

>表 1: 均質化プロトコル。Potter-Elvehjem組織グラインダーが50rpmの均質化速度で10gのヒト前頭皮質を均質化するための均質化プロトコル。最初の数回のストロークでは、ミンチ組織を均質化するために追加の時間が必要であることに注意してください。この最初の均質化後、各ストロークの持続時間は 12 秒です (下向きの動きは 6 秒、上向きの動きは 6 秒)。したがって、最初の均質化後、1分で5ストローク、または5分で25ストロークを達成できます。

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結果

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figure-results-1
図1:キャピラリーアイソレーションのフローチャート。(A)ピクトグラムは、新鮮なヒト組織から脳の毛細血管を分離する手順の主要なステップを示しています。 (B)写真は、分離直後の光学顕微鏡下(倍率100倍)で分離されたヒトの脳毛細血管を示しています。

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
個人用保護具(PPE)
Diamond Grip Plus ラテックスグローブ、Microflex MediumVWR, Radnor, PA, USA32916-636PPEの
使い捨て保護白衣VWR, Radnor, PA, USA470146から214PPE。人的材料の性質上、使い捨ての白衣の使用をお勧めします
フェイスシールド、使い捨てサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ19460102PPE;人的材料の性質上、使い捨てのフェイスシールドの使用をお勧めします
>安全資料
Clavies高温オートクレーブバッグ8 x 12サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ01-815-6
Versiドライベンチペーパー18 "x 20"サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ14〜206〜32作業領域をカバーするために
VWRシャープスコンテナシステムサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ75800から272使用済みのメス用
漂白剤8.2%クロロックス殺菌剤64オンス英国サプライセンター、レキシントン、ケンタッキー州、米国323775
>機器
4°C冷蔵庫サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ13-986-148
Accume BASIC AB15 pHメーターサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国ペンシルベニア州ピッツバーグAB15
ハイドルフRZR2102コントロールハイドルフ、エルクグローブビレッジ、イリノイ州、アメリカ〒501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR遠心分離機サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ75004521
ライカL2 解剖顕微鏡Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA (米国イリノイ州バッファローグローブ髄膜の除去に使用
ポリトロン PT2500 ホモジナイザーKinematica AG、ルツェルン、スイス9158168
スケールP-403Denver Instrument, Bohemia, NY, USA (米国ニューヨーク州ボヘミア)191392
スタンダードミニスターサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ1151050
サーモフラスコ液体窒素デュワーサーマルサイエンティフィック、マンスファイル、テキサス州、米国11-670-4Cティッシュを凍結するために使用
Voyager Pro分析天びんオーハウス、パーシッパニー、ニュージャージー州、米国VP214CN
ZEISS Axiovert マイクロコープCarl Zeiss, Inc 米国ニューヨーク州ソーンウッド孤立した毛細血管のチェックに使用
工具・ガラス製品
フィンピペットIIピペット1-5mLサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ21377823T1キャピラリーをフィルターから洗い流します
フィンピペットIIピペット 100-1,000 μLサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ21377821T1ペレットをBSAに再懸濁
ピペットボーイインテグラ、ハドソン、ニューハンプシャー州、米国739658
50 mL ファルコンチューブ 25/ラック - 500/csVWR, Radnor, PA, USA21008-951
EISCOメスブレードサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国ペンシルベニア州ピッツバーグS95938C脳組織をミンチに
パラフィルムVWR, Radnor, PA, USA52858-000ビーカーとメスフラスコを覆うため
Thermo Scientific Finntip ピペットチップ 5 mLサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ21-377-304フィルターから毛細血管を洗い流すには
60 mLシリンジ(Luer-Lok入りサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国ペンシルベニア州ピッツバーグBD309653コネクタリングと併用してキャピラリーをフィルタリング
メスのハンドル#4Fine Science Tools、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国10060-13ミンチに使用
デュモン鉗子#5Fine Science Tools、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国11251から10髄膜の除去に使用
Potter-ElvehjemティッシュグラインダーThomas Scientific、米国ニュージャージー州スウェーデスボロ3.43E+2850 mL容量、クリアランス:150-230 μm
ダウンスホモジナイザーVWR、ラドナーPA USA62400-64215 mL容量、クリアランス:80-130 μm
スペクトル/メッシュウーブンフィルター(300μm)Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA (米国カリフォルニア州ランチョドミンゲス)146424毛細管懸濁液をろ過して、残っている可能性のある髄膜を除去するために使用されます
pluriStrainers(細孔径:30μm)pluriSelect Life Science、ライプツィヒ、ドイツ43-50030から03
コネクタリングpluriSelect Life Science、ライプツィヒ、ドイツ41-50000-03複数回再利用
1Lメスフラスコアイソレーションバッファーの調製に
1Lビーカー1% BSAの調製用
攪拌棒1% BSAおよびFicoll®の調製用
ショットボトル(60mL)Ficoll®の準備のために
アイスバケツすべてを冷たく保つために
100mmシャーレ脳組織のミンチ用
組織培養細胞スクレーパーVWR, Radnor, PA, USA89260-222遠心分離後に上清を除去するには
化学品
BSAフラクションV、A-9647Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)A9647-500グラム前日にCa2+およびMg2+を含むDPBSで調製します。準備中の泡を避けてください。冷蔵庫に保管してください。使用前に10分間ゆっくりと攪拌してください。
Ca2+ および Mg2+ の DPBSハイクロンSH30264.FSDPBS - アイソレーション バッファーの一部
フィコールPM400Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)F4375ここでは正確な測定が重要です。攪拌棒付きのボトルで計量します。DPBSを追加した後、激しく振ってください。冷蔵庫O/Nに保管してください。午前中には晴れ間が出るでしょう。使用前に10〜15分間静かにかき混ぜてください。使用するまで氷の上に置いてください。
グルコース(D-(+)デキストロース)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)G7528グルコース(D-(+)デキストロース)濃度:5 mM
水酸化ナトリウム標準液Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)71474DPBSのpHを調整するには
ピルビン酸ナトリウムSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)P2256濃度:1 mM
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